饒習(xí)敏，歐陽瑤，顧延會

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 呼吸一科，貴州 遵義 563099)

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織中樹突狀細(xì)胞的變化

饒習(xí)敏，歐陽瑤，顧延會

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 呼吸一科，貴州 遵義 563099)

目的了解慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺組織中的DCsmRNA表達(dá)變化。方法通過煙熏+脂多糖(LPS)方法建立COPD大鼠模型。HE染色觀察氣道及肺組織病理學(xué)的改變，同時用熒光定量RT-PCR檢測CD86mRNA及OX-62mRNA在肺組織中的表達(dá)變化。結(jié)果COPD模型組大鼠肺組織HE染色符合慢性支氣管炎及肺氣腫的病理改變。與正常對照組相比，COPD模型組大鼠CD86mRNA及OX-62mRNA表達(dá)均增加(P<0.01)。結(jié)論COPD模型組大鼠第28天病理表現(xiàn)符合人類COPD的特征性病理改變，提示COPD大鼠模型建立成功。COPD模型組大鼠肺組織中CD86mRNA及OX-62mRNA的表達(dá)較正常對照組明顯升高，提示樹突狀細(xì)胞(DCs)在COPD大鼠肺部表達(dá)增加，這可能是COPD發(fā)生發(fā)展的重要因素。

慢性阻塞性肺疾??；樹突狀細(xì)胞；熒光定量PCR

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其病死率及死亡率高，且發(fā)病機(jī)制仍有較多因素不清。目前免疫反應(yīng)被認(rèn)為是COPD發(fā)生發(fā)展的一個重要機(jī)制。DCs是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞,其最大特點是能夠刺激初始T細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng),是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動者[1]。本研究通過煙熏加脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)氣道內(nèi)注入建立大鼠COPD模型,從基因水平測定大鼠肺組織中DCsmRNA的表達(dá)變化，并探討DCs與COPD發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性如何，為其藥物治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與標(biāo)本采集 清潔級雄性Wistar大鼠24只，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，[合格證號為：SCXK(渝)2007-0005]。通過煙熏+脂多糖方法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型[2]。4周后取肺組織放入加有1 mLTrizol的EP管中，并立即放入-80 ℃冰箱保存，以備RNA提取。

1.2 主要實驗試劑及儀器 脂多糖 (E.coli 055：B5)：美國Sigma公司產(chǎn)品，熒光定量RT-PCR試劑盒：大連TaKaRa公司，熒光定量RT-PCR引物(CD86、CD83、OX-62、β-actin) ：大連TaKaRa公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：大連TaKaRa公司，ICycler iQ熒光定量PCR儀 ：美國BIO-RAD公司。

1.3 熒光定量RT-PCR

1.3.1 cDNA的獲取 采用Trizol一步法進(jìn)行總RNA的提取，并用RT-PCR試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。調(diào)整各樣品總RNA濃度，使反轉(zhuǎn)錄體系中總RNA量一致，均為2.0 μg，確保定量精確性。建立10.0 μL反轉(zhuǎn)錄體系：5×PrimeScriptTMBuffer(for Real Time) 2 μL;PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μL;Oligo dT Primer(50 μm)*1 μL;Random 6mers(100 μm)*1 0.5 μL；Total RNA 3.5l；Rnase Free dH2O 3μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15min，85 ℃ 5 s。所得產(chǎn)物儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。建?5 μL熒光定量 PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM 7.5 μL;PCR Forward Primer(10 μm) 0.25 μL;PCR Reverse Primer(10 μm) 0.25 μL;cDNA模板3 μL ;dH2O 4 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 3 min,變性 95 ℃ 10 s,退火延伸 61.1 ℃ 30 s,融解 55 ℃ 10 s,共40個循環(huán)。

1.3.2 PCR引物的設(shè)計和合成 大鼠CD86及OX-62引物及內(nèi)參照β-actin引物由TaKaRa公司設(shè)計和合成，其序列如下(見表1)。

表1 PCR相關(guān)引物序列

名稱 引物序列PCR產(chǎn)物(bp)CD86上游5'-GATTGCAGGTCCCAGTTCACTTC-3'下游5'-CCACTGTCCTGCTTGGACTCAC-3'135OX-62上游5'-TGGCATTCAGTGGTCTGTGCTA-3'下游5'-CACCAAGGATCGGCAGTTCA-3'121β-actin上游5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'150

2 結(jié)果

熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，COPD模型組CD86 mRNA及OX-62 mRNA表達(dá)均增加(P<0.01，見表2、圖1)。

組別CD86OX-62NS組0.82±0.591.00±0.32COPD組10.09±5.15*14.4±0.80*

注：*與對照組相比P<0.01。

注：CD86。 圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果圖

3 討論

COPD是由多種復(fù)合因素構(gòu)成的一種疾病，其中卷煙煙霧等慢性刺激作用于肺部，是導(dǎo)致COPD發(fā)病的首要危險因素。此外，一些環(huán)境暴露或職業(yè)粉塵暴露也是COPD致病的重要因素，這些環(huán)境或職業(yè)有機(jī)粉塵的活性成分主要是內(nèi)毒素，它的主要成分是脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)。有文獻(xiàn)報道，長期暴露于含有LPS的粉塵中可以導(dǎo)致患者出現(xiàn)類似于COPD的臨床表現(xiàn)，本課題組前期已通過煙熏+脂多糖方法成功建立了COPD大鼠模型[2]。

目前國內(nèi)外關(guān)于DCs與COPD的研究結(jié)果并不一致。Rogers等研究發(fā)現(xiàn)吸煙COPD患者上皮組織和上皮下組織中DCs數(shù)目比已戒煙COPD患者均明顯減少[3]。劉俊達(dá)等研究COPD患者外周血DCs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)COPD急性加重期和穩(wěn)定期DCs的數(shù)量均小于正常人[4]。但有的研究結(jié)論與其并不一致[5-6]。我們前期的研究采用FCM檢測COPD患者、吸煙無COPD者及正常無吸煙者誘導(dǎo)痰中CD40和CD86的含量，發(fā)現(xiàn)COPD患者誘導(dǎo)痰中CD40和CD86的含量明顯高于吸煙無COPD組及正常無吸煙組，進(jìn)一步證實了DCs參與了COPD的發(fā)病過程[7]。本研究采用RT-PCR技術(shù)從基因水平來檢測COPD模型大鼠肺臟中DCs的mRNA的表達(dá)變化。通過本實驗得出結(jié)論：COPD模型組大鼠肺組織中CD86 mRNA及OX-62 mRNA的表達(dá)較正常對照組明顯升高(P<0.01)，提示樹突狀細(xì)胞在大鼠肺組織中的表達(dá)增加，這可能是COPD發(fā)生發(fā)展的重要因素。

[1] Maria-Luisa del Rio,Jose-Ignacio,Elisabeth Kremmer,et al.CD103-and CD103+Bronchial Lymph Node Dendritic Cells Are Specialized in Presenting and Cross- Presenting Inocuous Antigen to CD4+ and CD8+ T Cells[J].J Immunol，2007, 178(9):6861-6866.

[2] 顧延會,歐陽瑤.煙熏聯(lián)合脂多糖制備大鼠慢性阻塞性肺疾病動物模型[J].重慶醫(yī)學(xué),2012,41(13):1295-1296.

[3] Rogers A V,Edelroth,K Hattotuwa,et al.Bronchial mucosal dendritic cells in smokers and ex-smokers with COPD:an electron microscopic study[J]. Thorax, 2008,63:108-104.

[4] 劉駿達(dá),鄭小河,李雪影,等.慢性阻塞性肺病患者外周血樹突狀細(xì)胞的檢測及其臨床意義[J].海南醫(yī)學(xué),2005,16(3):8-9.

[5] 馬朝輝,張晶,陳若華,等.慢性阻塞性肺病模型大鼠肺組織樹突狀細(xì)胞的數(shù)量變化及藥物干預(yù)效果[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2009,30(6):706-709.

[6] 張寧,宋衛(wèi)東.慢性阻塞性肺氣腫的大鼠樹突狀細(xì)胞定量分析[J].中華全科醫(yī)學(xué),2010, 7(8):809-810.

[7] 歐陽瑤,符丹丹,薛令合.CD40和CD86在慢性阻塞性肺疾病患者誘導(dǎo)痰中的變化及意義[J].貴州醫(yī)藥,2011,35(6):487-490.

ExpressionofdendriticcellsmRNAinchronicobstructivepulmonarydiseaserats

Raoximin,Ouyangyao，Guyanhui

(Department of Respiratory Medicine,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo study the expression of Dendritic Cells (DCs) mRNA in the lung tissue of rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD).MethodsCOPD was induced by established cigarette smoke inhalation and intratracheal LPS solution application. The pathomorphological changes in the lung were observed by hematoxylin-eosin staining (HE).The expressions of CD86 mRNA and OX-62 mRNA in lung tissue were observed by RT-PCR.ResultsThe changes of pathology of the COPD model group at 28-day mimicked the pathology of COPD patients. The expression of CD86 mRNA and OX-62 mRNA in the lung tissue were significantly increased in COPD model group, compared with normal control group (P<0.01).ConclusionThe COPD rat model was established successfully by this combined methods. The expressions of DCs mRNA were increased in the lungs of rats with COPD. COPD is associated with creased numbers of DCs.

Chronic Obstructive Pulmonary Disease; dendritic cells; Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

貴州省科技廳社發(fā)公關(guān)項目(NO：黔合科SY制[2009]3053)。

歐陽瑤，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：COPD的發(fā)病機(jī)制，E-mail:ouyangyao116@sohu.com。

R563.3

A

1000-2715(2013)05-0410-03

[收稿2013-07-22;修回2013-09-18]

(編輯：譚秀榮)