郎長(zhǎng)會(huì)，彭龍英，束曉梅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 兒科，貴州 遵義 563099)

·技術(shù)與方法·

密度梯度法與羥乙基淀粉法培養(yǎng)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞比較

郎長(zhǎng)會(huì)，彭龍英，束曉梅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 兒科，貴州 遵義 563099)

目的比較密度梯度離心法與羥乙基淀粉法體外分離培養(yǎng)臍血間充質(zhì)細(xì)胞(hUCB-MSCs)的成功率，為今后細(xì)胞移植和基因治療提供重要的細(xì)胞來(lái)源。方法取44份足月兒順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)臍帶血，分為兩組，每組22份，分別用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法與羥乙基淀粉法分離臍血中單個(gè)核細(xì)胞，專(zhuān)用培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察兩種方法培養(yǎng)所得細(xì)胞的形態(tài)變化并繪制生長(zhǎng)曲線，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物CD14，CD29，CD44，CD45， CD105的表達(dá)。結(jié)果羥乙基淀粉法培養(yǎng)hUCB-MSCs的成功率(36.36%)高于密度梯度離心法結(jié)合貼壁法的培養(yǎng)成功率(9.1%)(P<0.05)。兩種方法所得細(xì)胞在形態(tài)、生長(zhǎng)曲線和表面標(biāo)志物CD14，CD29，CD44，CD45，CD105的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)論羥乙基淀粉法可以提高h(yuǎn)UCB-MSCs培養(yǎng)成功率，為hUCB-MSCs在臨床中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

密度梯度離心；貼壁篩選法；羥乙基淀粉；臍血；間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells MSCs)起源于中胚層，具有多向分化潛能[1]。MSCs是組織工程、細(xì)胞移植中發(fā)揮有效作用的理想種子細(xì)胞。近年來(lái)，文獻(xiàn)報(bào)道[2]多種組織(臍血、骨髓、牙齒、骨骼肌、肝、肺、羊水、胎盤(pán)及外周血等)可以分離出MSCs，尤其是臍血和骨髓。目前對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells BMMSCs)分離培養(yǎng)方法的研究較成熟，但由于其隨著年齡增長(zhǎng)分化能力及治療作用逐漸下降，且采集量有限，使其應(yīng)用受到限制[3-5]，而人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells hUCB-MSCs)具有來(lái)源豐富，取材方便，具有多向分化能力；免疫原性較弱等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞治療及基因治療中[6-8]。目前，從臍血分離MSCs的方法較多，各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)眾說(shuō)紛紜，且分離培養(yǎng)較為困難，尋找一種高效快速的分離方法迫在眉睫。有學(xué)者認(rèn)為羥乙基淀粉法可縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，可提高所得hUCB-MSCs純度。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較密度梯度離心法結(jié)合貼壁法與羥乙基淀粉法的培養(yǎng)成功率，試圖選擇一種高效體外分離方法從臍血中分離培養(yǎng)hUCB-MSCs，為以后在細(xì)胞移植和基因治療中提供重要的細(xì)胞來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料 人淋巴細(xì)胞分離液(天津顥洋、LTS1077)、羥乙基淀粉550(hydroxyethyl starch HES天津顥洋，分子量550)，紅細(xì)胞裂解液(Ammonium chloride Stem cell公司)，胎牛血清(Gibco)，臺(tái)盼蘭、PBS(北京中杉)，0.25%胰蛋白酶、hUCB-MSCs專(zhuān)用培養(yǎng)基(賽業(yè)生物科技有限公司)，bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 Sigma)，兔抗人FITC-CD44、FITC-CD105、PE-CD14、PE-CD29、PE-CD45、同型對(duì)照FITC-IgG1及PE-IgG1(北京博奧森生物有限公司)。

1.2 臍血來(lái)源 經(jīng)產(chǎn)婦及家屬知情同意后，于遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科采集,均來(lái)自正常足月順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)的健康產(chǎn)婦臍血44份(健康標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)肝炎、艾滋病及梅毒等傳染病)，分為對(duì)照組和HES組兩組，每組22份。每份臍血量約50～100 mL, 肝素鈉(20U/mL)抗凝，所有標(biāo)本均于采集后6h內(nèi)進(jìn)行分離。

1.3 方法

1.3.1 密度梯度分離 將抗凝的臍帶血與PBS等體積稀釋?zhuān)徛B加于淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 rpm，20 min，吸取中間白膜層，1 000 rpm，6 min，棄上清，PBS清洗一次(1 000 rpm，6 min)，棄上清。

1.3.2 HES分離 將臍血與6%羥乙基淀粉以4∶1比例混勻，常溫下靜置1h，取上清，將其緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 rpm，離心20 min，棄上清，PBS洗滌2次。

以上均加入紅細(xì)胞裂解液3 mL室溫靜置5～10 min，加入5 mL PBS，1 000 rpm，5 min，棄上清，以1×106個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于含有10%胎牛血清(fetal bovine serum FBS)、5 ng/mL堿性成纖維因子(basic fibroblast growth factor bFGF)的專(zhuān)用培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后半量換液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每三天全量換液一次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)(一般24 d至35 d)，PBS洗2次，0.25%胰酶消化1 min左右，待細(xì)胞開(kāi)始變圓時(shí)加入培養(yǎng)基終止消化，1 000 rpm，5 min，棄上清，以1∶2傳代，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.3.3 比較細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況 每天在倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞形態(tài)變化并拍照，各取兩組P3細(xì)胞每孔細(xì)胞以1×104接種于24孔板中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天取3孔用0.4%臺(tái)盼蘭染色行細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)檢測(cè)7 d。

1.3.4 流式細(xì)胞分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期P3細(xì)胞，0.25%胰酶消化，PBS洗滌二次，制成密度為1×106/mL的細(xì)胞懸液，每個(gè)流式管加100 μL細(xì)胞懸液，分別加入20 μL FITC-CD44，F(xiàn)ITC-CD105，PE -CD29，PE-CD14，PE-CD45，對(duì)照組分別加入同量的相應(yīng)的FITC-IgG1，PE-IgG1，冰上避光孵育30 min，PBS洗滌二次，1 000 rpm，離心5 min，重新制成細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)檢測(cè)和采用SPSS17.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法分離培養(yǎng)hUCB-MSCs及形態(tài)比較 兩種方法所得細(xì)胞接種24 h后，于倒置顯微鏡下觀察，大多數(shù)細(xì)胞為圓形，少部分細(xì)胞已貼壁。第5天可見(jiàn)多角形細(xì)胞和大量大而圓的破骨樣細(xì)胞及雜細(xì)胞，12 d后可見(jiàn)大量梭形細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，平均約28d(一般在24～25 d)可以傳代(圖1A、1B)。傳代后約12 h后細(xì)胞逐漸貼壁，細(xì)胞呈均一的梭形細(xì)胞，7～10 d可再次傳代，P3細(xì)胞得到形態(tài)均一， 6～7 d細(xì)胞融合率達(dá)90% (圖2A、2B，P3第2天)，兩種分離方法結(jié)合差速貼壁培養(yǎng)、純化后，所得細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別。

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 兩種分離方法所培養(yǎng)的P3細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線都近似“S”形，第1～3天生長(zhǎng)緩慢，從4 d開(kāi)始呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，5～6 d生長(zhǎng)緩慢(見(jiàn)圖3 )，且兩組細(xì)胞生長(zhǎng)速度無(wú)明顯區(qū)別。

注：A：為密度梯度離心法原代培養(yǎng)12 d;B：為羥乙基淀粉法原代培養(yǎng)12 d，兩組細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形，大部分細(xì)胞有折光性，均有雜細(xì)胞(相差顯微鏡×40)。 圖1 兩種分離方法原代hUCB-MSCs細(xì)胞形態(tài)

注：A:為對(duì)照組P3第3天;B：為HES組P3第2天，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,胞體較粗；無(wú)雜細(xì)胞(相差顯微鏡×40)。 圖2 兩種分離方法P3 hUCB-MSCs細(xì)胞形態(tài)

圖3 兩種方法第三代hUCB-MSCs生長(zhǎng)曲線

2.3 hUCB-MSCs表型鑒定 用流式細(xì)胞儀對(duì)兩種方法所得P3 hUCB-MSCs 表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，兩種分離方法采用相同培養(yǎng)方法，2組P3的 hUCB-MSCs 均表達(dá)CD29、CD44、CD105，不表達(dá)CD14、CD45，且上述表面分子表達(dá)百分率無(wú)明顯差異(P>0.05，見(jiàn)表1)。

2.4 兩種分離方法對(duì)hUCB-MSCs培養(yǎng)成功率的影響 兩種臍血分離方法所獲得的MNCs，采用相同的差速貼壁培養(yǎng)，均于10～12 d可形成hUCB-MSCs集落，并可傳代。hUCB-MSCs培養(yǎng)成功率對(duì)照組為9.1%，HES組則為36.36%，HES組成功率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

表1兩種分離方法的hUCB-MSCs表面標(biāo)志物的比較

組別 CD14CD29CD44CD45CD105對(duì)照組0.08±0.698.97±0.998.7±0.850.78±0.796.04±1.1HES組0.12±0.597.65±0.899.1±1.00.70±0.695.3±1.3

表2兩種不同臍帶血分離對(duì)hUCB-MSCs培養(yǎng)成功率的影響

組別培養(yǎng)成功數(shù)未成功數(shù)合計(jì)成功率%對(duì)照組220229.1HES組8142236.36合計(jì)10344445.46

注：對(duì)照組和HES組比較，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=4.658)。

3 討論

增殖能力強(qiáng)的hUCB-MSCs在特定誘導(dǎo)條件下可向各個(gè)胚層細(xì)胞分化，如內(nèi)胚層的腸上皮細(xì)胞、中胚層的骨組織及外胚層的神經(jīng)組織等，如在腦源性生長(zhǎng)因子(BDNF)作用下將其植入大鼠腦中可誘導(dǎo)向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，移植入腦的缺血部位可改善大鼠的腦功能恢復(fù)，移植入脊髓損傷小鼠可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[9-11]。基于其分化能力強(qiáng)、免疫原性較弱及多向分化的特點(diǎn)，hUCB-MSCs成為細(xì)胞工程中極具應(yīng)用前景的干細(xì)胞來(lái)源。hUCB-MSCs分離培養(yǎng)較困難是其臨床應(yīng)用受限的原因之一。目前，分離hUCB-MSCs方法種類(lèi)繁多、效果欠佳，尚無(wú)有效、公認(rèn)及穩(wěn)定的方法，主要有密度梯度離心法，羥乙基淀粉沉淀法，流式細(xì)胞分選法，免疫磁珠分選法，單細(xì)胞克隆法等[12]。流式細(xì)胞分選法和免疫磁珠分選法對(duì)細(xì)胞活性均影響較大且MSCs缺乏特異性標(biāo)志，單細(xì)胞克隆法實(shí)驗(yàn)條件要求比較高，臍血量大，不適用。Perutelip[13]認(rèn)為羥乙基淀粉對(duì)紅細(xì)胞有較強(qiáng)的凝集作用，可提高h(yuǎn)UCB-MSCs的純度及成功率，但尚存爭(zhēng)議。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較密度梯度離心法結(jié)合貼壁法、羥乙基淀粉沉淀法分離培養(yǎng)hUCB-MSCs。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看到，羥乙基淀粉沉淀法獲得的MNCs，hUCB-MSCs培養(yǎng)成功率比密度梯度離心法要高。兩種方法所得細(xì)胞均高表達(dá)MSCs表面抗原CD29、CD105、CD44，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原CD45 及CD14。原代培養(yǎng)時(shí)所得單個(gè)核細(xì)胞中存在有大量圓形破骨細(xì)胞影響MSCs的生長(zhǎng)，隨著逐漸換液傳代、不斷差速貼壁培養(yǎng)，破骨樣細(xì)胞可被去除，細(xì)胞傳至P3時(shí)已得到純度較高的hUCB-MSCs，且生長(zhǎng)速度較快。王穎超等[14]通過(guò)比較兩種分離方法培養(yǎng)hUCB-MSCs，表明羥乙基淀粉沉淀法可以得到更多的MSCs，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；Jaatinen1[15]和Fuss[16]表明密度梯度離心法的培養(yǎng)率較低，其原因可能為從臍血分離單個(gè)核細(xì)胞中混雜紅細(xì)胞太多，在離心時(shí)并不是所有紅細(xì)胞都會(huì)沉到底層，一些紅細(xì)胞相反會(huì)介于血漿與淋巴分離液之間的單核細(xì)胞層，而且離心紅細(xì)胞沉降時(shí)可能與某些單核細(xì)胞粘附，導(dǎo)致單個(gè)核細(xì)胞沉到底層，使得本來(lái)就很少的單核細(xì)胞更少，導(dǎo)致該方法培養(yǎng)hUCB-MSCs的成功率更低。所以本實(shí)驗(yàn)在臍血在經(jīng)HES處理后用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，使其成功率提高[17]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hUCB-MSCs專(zhuān)用培養(yǎng)基適宜于hUCB-MSCs生長(zhǎng)；血清濃度不宜過(guò)高，應(yīng)選用10%FBS，因血清濃度過(guò)高使得雜細(xì)胞大量生長(zhǎng)，不利于MSCs生長(zhǎng)；首次換液時(shí)間3 d，過(guò)早不利于細(xì)胞貼壁，過(guò)晚大量破骨樣細(xì)胞生長(zhǎng)，表明經(jīng)傳代培養(yǎng)后可得到均一的MSCs。

從本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)：在將稀釋的臍血疊加到淋巴分離液面上時(shí)，勿將臍血沉至淋巴分離液下，這樣使得離心后白膜層不明顯至失敗；在吸取分離液與血清之間的白膜層時(shí)要緩慢小心仔細(xì)操作，若操作不當(dāng)，吸取過(guò)多紅細(xì)胞分離易失??；臍血量較多時(shí)羥乙基淀粉沉淀法更簡(jiǎn)便。

綜上所述，羥乙基淀粉沉淀法的成功率比常規(guī)密度梯度離心法要高，臍血經(jīng)過(guò)羥乙基淀粉沉淀后可使紅細(xì)胞沉至管底，對(duì)MNC無(wú)影響，細(xì)胞污染較小，而密度梯度離心法所得細(xì)胞含有大量紅細(xì)胞和破骨樣細(xì)胞，分離效果不穩(wěn)定，不利于MSCs生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)為分離培養(yǎng)hUCB-MSCs提供有利的分離及培養(yǎng)方法，為以后誘導(dǎo)其向各種組織細(xì)胞分化及在細(xì)胞移植和基因治療中提供重要的細(xì)胞來(lái)源。

[1] Park K S, Lee Y S, Kang K S.In vitro neuronal and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood[J]. Veterinary Science,2006,7(4)：343-348.

[2] Erices A, Congrt P，Minguell P P.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood[J]. Haematology，2000，109(1):235-242.

[3] Lim J Y, Jeun S S, Lee K J，et al. Multiple stem cells traits of expanded rat bone marrow stromal cells[J]. Experimental Neurology,2006,199(2)：416-426.

[4] Kern S, Eichler H, Stoeve J, et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood,or adipose tissue[J]. Stem cells,2006,24(5)：1294-1301.

[5] Malgieri A,Kantzari E, Patrizi M P,et al. Bone marrow and umbilical cord blood human mesenchymal stem cells :state of the art[J]？Int J Clin Exp Med,2010,3(4)：248-269.

[6] Peters R,Wolf M J,Brock MVD，et al. Efficient generation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood in stroma-free liquid culture[J]. Plos one,2010,5(12)：1-14.

[7] Bourin P, Gadelorge M,Pevrafitte J A,et al. Mesenchymal progenitor cells:Tissue origin,isolation and culture[J]. Transfus Med Hemother,2008,35(3)：160-167.

[8] Bieback K,Kluter H. Mesenchymal stromal cells from umbilical cord blood[J]. Curr Stem Cell Res Ther，2007,2(4)：310-323.

[9] Lim J Y, Jeong C H, Jun J A, et al. Therapeutic effects of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells after intrathecal administration by lumbar puncture in a rat model of cerebral ischemia[J]. Stem Cell Res Ther, 2011，2(5):38.

[10] Lim J Y, Park S I, Oh J H, et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Stimulates the Neural Differentiation of Human Umbilical Cord Blood-Derived Mesenchymal Stem Cells and Survival of Differentiated Cells Through MAPK/ERK and PI3K/Akt-Dependent Signaling Pathways[J]. Neurosci Res，2008,86(10):2168-2178.

[11] Kuh S U, Cho Y E, Yoon D H, et al. Functional recovery after human umbilical cord blood cells transplantation with brain-derived neutrophic factor into the spinal cord injured rat[J]. Acta Neurochir, 2005, 147(9):985-992.

[12] Musina R A,Bekchanova E S,Belyavskii AV,et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells[J]. Exp Biology and Medicine,2007,143(1):16-20.

[13] Peruteli P,Catellani S,Scarsol，et al. Processing of human cord blood by three different procedures for red blood cell depletion and mononuclear cell recovery[J]. Vox Sanguinis,1999,76(4)：237-240.

[14] 王穎超，殷楚云，馮磊，等.三種不同方法分離臍血造血干細(xì)胞的效果比較[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2012，27(10)：766-768，794.

[15] Jaatinen T,Laine J.Isolation of Monenuclear Cells From human cord blood by Ficoll-Paque desity gradient[J]. Curr Protocol Stem Cell Bio,2007,Chapter 2:Unit 2A.

[16] Fuss I L,Kanof M E,Smith P D，et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood[J]. Curr protoc Immunol,2009,Chaptor 7:Unit7.1.

[17] Horn P,Bork S,Wagner W. Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis[J]. Methods Mol Biol,2011,698：23-25.

Comparisonoftwoseparationmethodsofculturinghumanumbilicalcordbloodmesenchymalstemcells

Langchanghui,Penglongying,Shuxiaomei

(Department of Pediatrics,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo explore an optimized isolation method of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (hUCB-MSCs).MethodsUmbilical cord blood cells were collected from full-term normal delivery or cesarean section delivery infants under aseptic condition. 44 samples of umbilical cord blood were collected, and divided into two groups. The density gradient centrifugation or hydroxyethyl starch sedimentation was used to isolate hUCB-MSCs with adherent culture, and compared. Mononuclear cells (MNCs) were harvested from human umbilical cord blood. The morphology of MNC and their growth characteristics were observed. The surface antigen phenotype was detected by flow cytometry.ResultsThe success rate of the hydroxyethyl starch sedimentation method was higher than that of density gradient centrifugation(P<0.05).The morphological changes and the surface markers CD14, CD29, CD44, CD45 and CD105 were not obviously different (P>0.05).ConclusionThe hydroxyethyl starch sedimentation culture could improve the success rate of hUCB-MSCs.

density gradient centrifugation; adherent culture; hydroxyethyl starch sedimentation; umbilical cord blood; mesenchymal stem cells

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO: 31260286)

束曉梅,女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病，E-mail:shuxiaomei@163.com。

R 329

A

1000-2715(2013)05-0477-04

[收稿2013-06-24;修回2013-07-28]

(編輯：王福軍)