靳志敏，段艷，通力嘎，賈雪暉，袁倩，靳燁

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

隨著人們生活水平的提高，心血管疾病患病率和死亡率的逐年上升，已成為引起人類死亡的主要?dú)⑹?。而血清中的膽固醇被認(rèn)為是誘發(fā)冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素［1］。國(guó)內(nèi)外均有大量研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在體內(nèi)外具有降低膽固醇的益生功能，長(zhǎng)期食用乳酸菌及其制品可降低血液中膽固醇含量，降低心血管病的發(fā)病率［2］。因此研究乳酸菌的降膽固醇性能及其生長(zhǎng)特性，對(duì)于開(kāi)發(fā)功能性發(fā)酵制品，豐富現(xiàn)有發(fā)酵制品的種類，提高發(fā)酵制品的附加值具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文旨在對(duì)經(jīng)初步篩選得到的，膽固醇降解率達(dá)40%以上的乳酸菌在模擬肉湯培養(yǎng)基中的膽固醇降解率及其生長(zhǎng)特性進(jìn)行進(jìn)一步研究，篩選高降解膽固醇能力及生長(zhǎng)性能良好的菌株，為篩選1 株性能優(yōu)良的乳酸菌作為發(fā)酵香腸發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院乳制品研究與培訓(xùn)中心保存，經(jīng)初步篩選得到的6 株降膽固醇性能優(yōu)良的乳酸菌［4］。

標(biāo)準(zhǔn)菌株:植物乳桿菌，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心，a2m 1.191。

培養(yǎng)基:膽固醇篩選培養(yǎng)基;MRS 培養(yǎng)基;模擬肉湯培養(yǎng)基;MRS +6% NaCl +150 mg/kg NaNO2［3］培養(yǎng)基;

模擬肉湯-CHOL:模擬肉湯液體培養(yǎng)基中添加0.2%(W/V)牛膽鹽和0.2%巰基乙酸鈉，121℃滅菌15 min 后，添加2%的(1.0 g/100 mL)無(wú)菌膽固醇溶液。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液:精確稱量膽固醇50.0 mg，用無(wú)水乙醇定容于50 mL 的容量瓶中，配成1 mg/mL 的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液。精確吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL 容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，進(jìn)而得到10、20、30、40、50 μg/mL 的梯度溶液。

儀器設(shè)備:ZHJH-C1214C 超凈工作臺(tái);南京依貝儀器設(shè)備有限公司;YXQ-LS-SⅡ立式壓力蒸氣滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膽固醇降解率的測(cè)定

1.2.1.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確吸取各梯度膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL 于試管中，在真空條件下抽干，然后準(zhǔn)確加入2.0 mL 鄰苯二甲醛溶液振蕩使之充分溶解，放置10 min 后加入1.0 mL 的濃H2SO4，混合均勻，室溫放置10 min 使之顯色，在550 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(2.0 mL 鄰苯二甲醛溶液加入1.0 mL 的濃硫酸，室溫放置10 min 調(diào)零)。以O(shè)D550值為橫坐標(biāo)，膽固醇濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［4］。

1.2.1.2 樣品處理及菌株降膽固醇率的測(cè)定

將各菌株于液體MRS 培養(yǎng)基中活化3 代后按2%接種量接于模擬肉湯-CHOL 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后于12 000 r/min 離心10 min 后，取上清液0.5 mL 用鄰苯二甲醛比色法測(cè)定其膽固醇含量［5－8］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.2.2 菌株生長(zhǎng)能力測(cè)定

1.2.2.1 不同pH 值生長(zhǎng)能力的測(cè)定

將菌株于液體MRS 培養(yǎng)基中活化3 代后按2%接種量接種于pH 3.5，pH 4.5，pH 5.5，pH 9.6 液體MRS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h 以不同pH 的MRS 為空白對(duì)照于600 nm 下測(cè)OD值［9］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.2.2.2 菌株不同溫度生長(zhǎng)能力測(cè)定

將菌株于液體MRS 培養(yǎng)基中活化3 代后按2%接種量接種于液體MRS 培養(yǎng)基中，分別于4，10，15，25，30，45℃培養(yǎng)24 h，以MRS 為空白對(duì)照于600 nm下測(cè)OD值［10，12］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

1.2.3 菌株不同培養(yǎng)基中不同天數(shù)的產(chǎn)酸能力測(cè)定

將于液體MRS 培養(yǎng)基中活化3 代的菌株以2%接種量接種于液體MRS 培養(yǎng)基，模擬肉湯培養(yǎng)基，MRS+6% NaCl +150 mg/kg NaNO2培養(yǎng)基［3］中，分別于第1，2，4，6，8，10，13 天時(shí)測(cè)定其pH 值［3，11］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌株對(duì)膽固醇降解率

2.1.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

以O(shè)D550值為橫坐標(biāo)，膽固醇濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y= 349.66x－0.549，R2=0.9915。

2.1.2 膽固醇降解率

試驗(yàn)菌株在添加0.2%(W/V)牛膽鹽和0.2%巰基乙酸鈉，2%的(1.0 g/100 mL)無(wú)菌膽固醇溶液培養(yǎng)基中的膽固醇降解率如表1 所示。

表1 不同菌株膽固醇降解率Table 1 Cholesterol-reducing ability of different strains

從表1 可以看出，經(jīng)過(guò)初步篩選好的，對(duì)于降膽固醇降解能力較好的6 株乳酸菌，其膽固醇降解能力與標(biāo)準(zhǔn)菌相比差異較大，其中只有TF3201 號(hào)菌株降解率低于標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)株，其它菌株膽固醇降解率遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)菌，其中2 －2B33、TE7401、TE5301、TF5201 號(hào)菌株降解率較好都達(dá)到70%以上。

2.2 菌株生長(zhǎng)能力

2.2.1 不同pH 生長(zhǎng)能力

乳酸菌在不同pH 條件下的生長(zhǎng)能力見(jiàn)圖1。

圖1 不同pH 值下菌株的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth ability in different pH of different strains

從圖1 可以看出，在pH 3.5 時(shí)2 －2B33 號(hào)菌株的生長(zhǎng)能力較標(biāo)準(zhǔn)菌株差，在pH 4.5、pH 5.5 時(shí)除菌株2 －2B33，TF7401 外其余菌株生長(zhǎng)能力都強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，在pH 9.9 時(shí)各株菌生長(zhǎng)性能都弱于標(biāo)準(zhǔn)菌。但六株乳酸菌對(duì)pH 值的適應(yīng)范圍都較廣，在太酸或太堿條件下其生長(zhǎng)能力受到了一定影響，但各株菌在pH 4.5、pH 5.5 時(shí)生長(zhǎng)能力都較好。

2.2.2 不同溫度生長(zhǎng)能力

乳酸菌在不同溫度下的生長(zhǎng)能力見(jiàn)圖2。

圖2 不同溫度下菌株生長(zhǎng)能力Fig.2 Growth ability in different temperature of different strains

從圖2 可以看出，不同溫度對(duì)菌株的影響不同，6株乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度都為30℃。菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)速度差異顯著，溫度從10℃上升至30℃的過(guò)程中，生長(zhǎng)速度隨溫度的升高而加快;當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，生長(zhǎng)速度反而減慢。而在4℃，10℃時(shí)菌株的生長(zhǎng)速度相近且生長(zhǎng)能力都較弱。各菌株在低于25℃時(shí)其生長(zhǎng)能力弱于標(biāo)準(zhǔn)菌，但在25℃、30℃時(shí)除2 －2B33 外其余菌株生長(zhǎng)性能與標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)株相近且在45℃時(shí)菌株生長(zhǎng)性能都優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌株。菌株的整體生長(zhǎng)速度依次為:V30℃＞V25℃＞V45℃＞V15℃＞V10℃＞V4℃。

2.3 不同培養(yǎng)基中不同天數(shù)的產(chǎn)酸能力

2.3.1 MRS 培養(yǎng)基

乳酸菌在MRS 培養(yǎng)基中不同時(shí)間的產(chǎn)酸情況見(jiàn)表2。

表2 菌株在MRS 培養(yǎng)基中pH 值變化Table 2 Eventually pH of Strains in different days in media MRS

從表2 可知，不同菌株在MRS 培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸能力稍有不同，6 株菌的產(chǎn)酸能力都較強(qiáng)但稍弱于標(biāo)準(zhǔn)菌株，各菌株培養(yǎng)1d 時(shí)pH 值就可降到4 以下，5 號(hào)菌株pH 值達(dá)到了3.88，同時(shí)TF5201，2 －2B33，TE7401 號(hào)菌株2 d 后的產(chǎn)酸性能較其他菌株稍好，F(xiàn)D4401、TF5201、TE5301 號(hào)菌株在10 天后其pH 值有所回升其原因還有待進(jìn)一步研究。

2.3.2 模擬肉湯培養(yǎng)基

乳酸菌在模擬肉湯培養(yǎng)基中不同天數(shù)的產(chǎn)酸情況見(jiàn)表3。

表3 菌株在模擬肉湯培養(yǎng)基中pH 值變化Table 3 Eventually pH of Strains in different days in media Meat Model

由表3 可以看出，不同菌株在模擬肉湯培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸性能差異不大，培養(yǎng)1 d 時(shí)各株菌的pH 值可降到4.00 左右，2 d 后各株菌的pH 值達(dá)到最低且基本保持穩(wěn)定，各菌株在模擬肉湯中產(chǎn)酸性能稍弱于標(biāo)準(zhǔn)菌。

2.3.3 MRS+6% NaCl +150mg/kg NaNO2培養(yǎng)基

乳酸菌在MRS+6% NaCl +150mg/kg NaNO 培養(yǎng)基中不同天數(shù)的產(chǎn)酸情況見(jiàn)表4。

表4 菌株在MRS+6% NaCl+150mg/kg NaNO2 培養(yǎng)基中pH 值變化Table 4 Eventually pH of Strains in different days in media MRS+6% NaCl +150 mg/kg NaNO2

由表4 可知，不同菌株在MRS +6% NaCl +150 mg/kg NaNO2培養(yǎng)基中產(chǎn)酸性能差異不大，各株菌在1 天后pH 值已降到4.00 左右且產(chǎn)酸性能稍弱于標(biāo)準(zhǔn)菌，但2 d 后各菌株pH 值降到3.70 左右且保持穩(wěn)定，其中除2 －2B33 號(hào)菌株外，其余菌株產(chǎn)酸性能都稍強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌。

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中分離的6 株降膽固醇性能優(yōu)良的乳酸菌對(duì)肉品中膽固醇降解作用及其生長(zhǎng)特性，得菌株TE5201，2 － 2B33，TE7401，TE5301 的膽固醇降解率達(dá)70%以上，而標(biāo)準(zhǔn)菌膽固醇降解率為51.76%，TF3201 號(hào)菌株的降解率為41.39%且低于標(biāo)準(zhǔn)菌。在不同溫度、不同pH 條件下菌株FD4401，TE5201，TE3201，TE5301 生長(zhǎng)性能都較好且都優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌，同時(shí)，各菌株經(jīng)過(guò)在不同培養(yǎng)基中13 天的培養(yǎng)，只有在MRS +6% NaCl +150 mg/kg NaNO2培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸性能稍優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，其中菌株TE7401 在MRS、模擬肉湯、MRS+6% NaCl+150 mg/kg NaNO2培養(yǎng)基中13 d 內(nèi)產(chǎn)酸性能較好，尤其在MRS +6% NaCl +150 mg/kg NaNO2培養(yǎng)基中1 d 后的pH 值已降到3.98，2 d 后pH 值降到3.65且保持穩(wěn)定。發(fā)酵劑發(fā)酵性能較好這為肉制品發(fā)酵時(shí)快速產(chǎn)酸，提高產(chǎn)酸力，為有效抑制雜菌打下了良好的基礎(chǔ)。故TE7401 號(hào)菌可做為1 株降膽固醇性能、生長(zhǎng)性能良好的肉制品發(fā)酵劑。

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