王志萍，黎 芳，陳 勇，王 勤，賀 穎，黃 歡

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥劑教研室，廣西南寧 530001)

壯藥婦雅凈顆粒原方是廣西壯醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，由火炭母(拉丁名Polygonum chinensis;壯語名Gaeumei)、大血藤(拉丁名Phellodendri Cortex;壯語名Gaebengzlaz)、虎杖(拉丁名Polygoni cuspidate Rhizoma et Radix;壯語名Godienggangh)、蛇床子(拉丁名Cnidii Fructus;壯語名Gosezcangzswj)等壯藥材為主，組成一個(gè)清熱毒、除濕毒、滅蟲毒、止瘙癢、消腫痛的壯藥復(fù)方，在壯醫(yī)臨床實(shí)踐中，用于子宮寒冷不孕，隆白呆(帶下)，歇唅(陰癢)，能唅能累(濕疹)、京尹(痛經(jīng))，諾吟尹(筋骨酸痛)，林得叮相(跌打損傷)，痂(廯)，唄叮(疔瘡)及唄農(nóng)(癰瘡)等癥［1］，有很好的療效。但由于湯劑形式不利于患者使用和貯存，本課題組在廣西科技廳的大力支持下，擬把該湯劑研制成顆粒劑——壯藥婦雅凈顆粒。為了確保壯藥婦雅凈顆粒的質(zhì)量，參考相關(guān)文獻(xiàn)［2-8］，加上綜合分析該顆粒的處方組成，方中的虎杖、蛇床子為主要組分，而虎杖苷和蛇床子素又是這兩味藥材的活性成分，故采用高效液相色譜法對(duì)顆粒中的虎杖苷和蛇床子素進(jìn)行定量測定;考慮方中火炭母、大血藤、黃柏等也是較重要的組分，故采用薄層色譜法對(duì)顆粒中的火炭母、大血藤、黃柏進(jìn)行定性鑒別;以全面確保壯藥婦雅凈顆粒的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 B3200S—T超聲波清洗儀(北京BRANSON);BS224S電子天平(北京賽多利斯);Agilent 1100(DAD、VWD)高效液相色譜儀(美國安捷倫);快速水分測定儀(瑞士梅特勒托利多公司)。

1.2 試藥 壯藥婦雅凈顆粒(廣西中醫(yī)藥大學(xué)制劑工程中心研制，批號(hào):110830，110831，110901);蛇床子素(1108022-200305)、虎杖苷(111575-200502)、槲皮素(100081-200406)、鹽酸小檗堿(110713-200208)、大血藤、火炭母上述對(duì)照品和對(duì)照藥材均由中國藥品生物制品檢定所提供。實(shí)驗(yàn)用藥材虎杖、蛇床子等，輔料糊精、硬脂酸鎂質(zhì)量符合《中國藥典》2010年版標(biāo)準(zhǔn)。甲醇、乙腈為色譜純;水為重純化水;其他試劑為分析純。

2 薄層鑒別

2.1 火炭母的薄層鑒別［2］取本品顆粒10 g，研細(xì)，過篩，加70%乙醇50 mL，鹽酸3 mL，加熱回流3 h，濾過，濾液做供試品溶液。精密稱取槲皮素對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含0.5 mg槲皮素作為對(duì)照品溶液。另取處方中無火炭母的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(2010年版《中國藥典》一部附錄ⅥB)，吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照在相應(yīng)的位置上無斑點(diǎn)，展開系統(tǒng)的分離效果良好，結(jié)果見圖1。

圖1 火炭母薄層鑒別Fig.1 TLC chromatogram of Polygonum chinensis

2.2 大血藤的薄層鑒別［2］取本品顆粒10 g，研細(xì)，過篩，加50 mL甲醇超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?%氫氧化鈉溶液100 mL使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，用乙醚振搖提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取大血藤對(duì)照藥材5 g同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方中稱取無大血藤的藥粉10 g，按供試品的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(2010年版《中國藥典》一部附錄ⅥB)吸取上述3種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(8∶1∶0.8)為展開劑。展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照在相應(yīng)的位置上無斑點(diǎn)，結(jié)果見圖2。

圖2 大血藤薄層鑒別Fig.2 TLC chromatogram of Sargentodoxa cuneata

2.3 黃柏的薄層鑒別［2-3］取本品顆粒1 g，研細(xì)，過篩，加50 mL甲醇，加熱回流30 min，濾過，濾液作為供試品溶液。取黃柏對(duì)照藥材50 mg，加甲醇5 mL，按供試品溶液的制備方法制備對(duì)照藥材溶液。按處方中稱取無黃柏的藥粉0.5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇配制每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(2010年版中國藥典一部附錄ⅥB)，吸取上述4種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶1)為展開劑。置氨蒸氣預(yù)飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照在相應(yīng)的位置上無熒光斑點(diǎn)，結(jié)果見圖3。

圖3 黃柏薄層鑒別Fig.3 TLC chromatogram of Phellodendri Cortex

3 定量測定

3.1 色譜條件 Waters色譜柱(250 mm×4.6 mm，4.5μm)，體積流量0.8 mL/min，柱溫35.0℃，檢測波長322 nm;以乙腈和水為流動(dòng)相，梯度洗度，0～20 min(15%乙腈)，20～22 min(15% ～65%乙腈)，22～34 min(65%乙腈)。

3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的虎杖苷對(duì)照品適量，加50%乙醇制成每1 mL中含32μg虎杖苷的溶液，得虎杖苷對(duì)照品溶液。精密稱取蛇床子素對(duì)照品適量，加50%乙醇制成每1 mL中含62μg蛇床子素的溶液，得蛇床子素對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液制備 取婦雅凈顆粒樣品(110830)，研細(xì)，精密稱取0.5 g，置具塞錐形瓶中，加50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，回流提取30 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻。濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對(duì)照樣品的制備 取缺虎杖和蛇床子的樣品0.5 g，按供試品溶液的制備方法制備缺虎杖和蛇床子的陰性供試品溶液。

3.5 干擾性試驗(yàn)考察 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各5μL，依照上述色譜條件測定，記錄色譜圖，陰性供試品溶液在選定條件下，其圖譜在虎杖苷和蛇床子素位置處無相應(yīng)的色譜峰，且虎杖苷和蛇床子素的色譜峰能與其他組分的色譜峰達(dá)到基線分離，說明陰性無干擾，結(jié)果見圖4。

圖4 虎杖苷和蛇床子素HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of polydatin and osthole

3.6 線性關(guān)系考察 按3.1項(xiàng)色譜條件，分別吸取虎杖苷、蛇床子素對(duì)照品溶液2、5、10、15、20μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，分別得回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程(n=5)Tab.1 Equations of linear regression(n=5)

3.7 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取虎杖苷和蛇床子素對(duì)照品溶液5μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，虎杖苷、蛇床子素峰面積的RSD分別為0.79%和0.83%(n=5)，表明儀器精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液5μL，于0、1、2、3、5、12、24 h進(jìn)樣，記錄每次進(jìn)樣的峰面積。結(jié)果虎杖苷、蛇床子素RSD分別為0.66%和1.05%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批樣品(110830)，按供試品溶液的制備方法平行制備6份，按照3.1項(xiàng)色譜條件，測定峰面積，虎杖苷和蛇床子素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.45 mg/g和1.05 mg/g，RSD分別為0.35%和0.46%，表明該方法的重復(fù)性較好。

3.10 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取己知含有量的樣品(110830)6份，每份0.25 g，分別加虎杖苷對(duì)照品溶液5 mL，蛇床子素對(duì)照品溶液5 mL，加50%乙醇定容至50 mL。按成品供試液制備方法制備試液，依法測定各樣品中虎杖苷和蛇床子素的量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2、表3。

表2 虎杖苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of revovery tests for polydatin(n=6)

表3 蛇床子素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of revovery tests for osthole(n=6)

3.11 樣品測定 取3批樣品，研細(xì)，分別精密稱取0.5 g，按供試品溶液的制備方法制備樣品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液和樣品溶液各5μL，按3.1項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.4 Results of sample determination(n=3)

4 討論

4.1 實(shí)驗(yàn)前比較了兩種不同展開系統(tǒng)在黃柏薄層色譜鑒別中展開效果，分別為乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶1)和石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(1∶1)［4］，結(jié)果在與對(duì)照品色譜的相應(yīng)位置處，均顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性均無干擾。但后者分離效果較差，且出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，故選擇前者作為黃柏薄層色譜中的展開系統(tǒng)。

4.2 虎杖苷為虎杖中的主要有效成分，具有祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰的功效，臨床用于治療慢性盆腔炎、高血脂癥、上呼吸道感染等疾?。?-10］，壯醫(yī)臨床用于除濕毒、通龍路、清熱毒、祛風(fēng)毒。治療蚌(黃疸)，京瑟(經(jīng)閉)、發(fā)旺(風(fēng)濕骨痛)、林得叮相(跌打損傷)、唄農(nóng)(癰瘡)、埃病(咳嗽);外治滲襠相(燒燙傷)［11］。蛇床子素是蛇床子的主要有效成分，具有溫腎壯陽、燥濕、祛風(fēng)、殺蟲的功效，臨床多復(fù)方形式用以治療宮頸炎，外陰及肛門部瘙癢，濕疹，龜頭包皮念珠菌病，滴蟲等疾?。?2-14］，壯醫(yī)臨床多用于除濕毒，祛風(fēng)毒，補(bǔ)腎陽，殺蟲毒，止瘙癢。治療委約(陽痿)，腰痛，子宮寒冷不孕，隆白呆(帶下)，歇唅(陰癢)，能唅能累(濕疹)［11］。

4.3 因虎杖苷與蛇床子數(shù)最大紫外吸收波長不同，UV光譜掃描虎杖苷最大吸收波長為306 nm、317 nm，蛇床子素的最大吸收波長為322 nm。經(jīng)測定虎杖苷在306 nm、317 nm的吸光度與在322 nm的吸光度值相差不大，而蛇床子在306 nm的吸光度僅322 nm的吸光度值73.06%，為能在同一波長下同時(shí)測定兩物質(zhì)，因此選擇322 nm為測定波長。

4.4 比較了超聲提取30 min和熱回流30 min提取方法兩種提取方法，結(jié)果表明:熱回流提取出的虎杖苷和蛇床子素的量較超聲提取的高許多，因此，選擇熱回流提取方法進(jìn)行提取。

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