康美玲，田忠景，許慶鵬

(棗莊學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160)

利用兩種電泳技術(shù)分析番茄品種醇溶蛋白及其親緣關(guān)系

康美玲，田忠景，許慶鵬

(棗莊學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160)

本文利用番茄種子醇溶蛋白電泳圖譜鑒定番茄各個品種之間的親緣關(guān)系，采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳( A- PAGE) 和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE)對棗莊市售10種番茄品種的醇溶蛋白電泳圖譜的分析.結(jié)果表明：不同物種間的醇溶蛋白譜帶存在一定差異且這種差異反映一定的關(guān)系.10種番茄醇溶蛋白分離譜帶8條，大部分具有5條相同譜帶，少部分譜帶數(shù)量較少，最少譜帶4條，經(jīng)過遺傳相似性與遺傳多樣性分析番茄的親緣關(guān)系，經(jīng)過遺傳多樣性聚類分析，將10種番茄在一定水平上，聚為5類.為棗莊番茄品種的親緣關(guān)系分析以及遺傳育種工作提供了依據(jù).

番茄；醇溶蛋白；電泳；A-PAGE；SDS-PAGE①

1 前言

1.1 醇溶蛋白的研究意義

種子貯藏蛋白是基因表達(dá)的產(chǎn)物直接而且穩(wěn)定,能確實反映出不同基因型的類型、個體間存在的遺傳差異[1]；而且這種差異不會受到植物生長環(huán)境的影響.所以，種子貯藏蛋白電泳分析在國內(nèi)外受到普遍重視[2]，它在研究植物種子親緣關(guān)系、起源、分類、演化等方面跟傳統(tǒng)的植物學(xué)性狀、特性鑒定比較更加深入、準(zhǔn)確、快速[3].

1.2 番茄的醇溶蛋白的研究現(xiàn)狀

近年來，李守明[4]等在利用兩種電泳技術(shù)分析大麥品種的醇溶蛋白差異及親緣關(guān)系研究的得出：目前， 利用蛋白質(zhì)電泳鑒定品種的方法較多，主要分為酸性和堿性兩大體系.鹽溶蛋白SDS-PAGE 以及醇溶蛋白A-PAGE 因其具有豐富的多態(tài)性已被廣泛用于品種鑒定、品質(zhì)分析和種質(zhì)資源篩選[5,6].貯藏蛋白電泳技術(shù)在不斷地改進(jìn)和完善, 并廣泛應(yīng)用于小麥[7-10]、玉米、大麥、棉花、辣椒、向日葵、大麥[11-14]等作物的品種鑒定.

種子蛋白電泳分析, 國內(nèi)外在園藝作物上極少報道, 有關(guān)番茄的文獻(xiàn)也很少[15].

張彥萍等[1]對番茄屬部分種的親緣關(guān)系電泳檢測研究中只采用了A-PEGE電泳技術(shù)對番茄品種醇溶蛋白進(jìn)行了電泳實驗.結(jié)果表明: 物種間的醇溶蛋白圖譜差異能夠反映一定的關(guān)系；醇溶蛋白分析支持了將醋栗番茄和小花番茄分別獨立為種的觀點, 櫻桃番茄是普通番茄祖先.

1.3 選題依據(jù)

番茄屬包括栽培番茄及其近緣的野生種，種質(zhì)資源非常豐富.番茄屬的分類經(jīng)歷了一個相當(dāng)長的過程，研究者眾多，但至今對其屬中的劃分仍存在許多分歧，尤其是該屬植物物種間親緣演化關(guān)系至今仍然不清楚，且某些物種系統(tǒng)發(fā)育地位尚未確立.這影響了番茄種質(zhì)資源的整理和研究利用.番茄屬分類及親緣演化關(guān)系的研究，對于遺傳育種和生產(chǎn)實踐有著十分有價值，必須深入研究[16].

本研究利用SDS-PEGE[17-18]技術(shù)和A-PEGE[19]電泳技術(shù)對番茄屬的醇溶蛋白多樣性進(jìn)行分析，意義在于為該屬植物的分類和物種間親緣關(guān)系，以及種子遺傳純度鑒定提供一些蛋白質(zhì)方面的資料，并且比較兩種電泳技術(shù)，哪一種更加準(zhǔn)確的測定番茄的醇溶蛋白.

2 材料與儀器

2.1 試驗材料

棗莊市售的10種番茄： 禧慶紅梨；西豐粉麗；禧慶紅珠；白果強(qiáng)豐；黃貴妃；櫻桃番茄；帝皇紅櫻桃；中蔬四號；富貴嬌粉；臺灣圣美；L-402太空番茄

2.2 主要儀器

DDY-6C型電泳儀電泳槽(北京市六一儀器廠)

pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)

高速冷凍離心機(jī)(上海飛菲恰爾析儀器有限公司)

3 試驗方法

3.1試劑配制

30% Arc-Bis母液：稱取30g丙烯酰胺和0.45gN-N甲叉雙丙烯酰胺加超純水定容到100ml.

分離緩沖液：稱取20.7g Tris，用少量溶解后，以1N Hcl調(diào)節(jié)pH到8.8定容100ml 4℃存放.

濃縮膠緩沖液：取4.36g Tris，用少量溶解后，以1N Hcl調(diào)節(jié)pH到6.8定容100ml 4℃存放.

10%SDS：10g SDS溶于100ml水中，室溫存放

SDS-PAGE電極緩沖液：稱取15g Tris，72g甘氨酸5g SDS溶于水中以1N Hcl調(diào)節(jié)pH到8.3后定容1000ml，4℃存放用前稀釋5倍

1N HCl：5ml 36%HCl加水定容到100ml

A-PAGE凝膠緩沖液：0.845ml冰乙酸加0.0854g甘氨酸加水定容到1000ml

A-PAGE電極緩沖液4ml冰乙酸加0.4g甘氨酸加水定容到1000ml

0.2%硫酸亞鐵：0.1 g硫酸亞鐵溶于50 ml水中

4%維生素C：0.4 g維生素C溶于10 ml水中

24%尿素：12g尿素溶于50 ml水中

樣品提取液：4.2 ml dH2o+1 ml0.5M Tris-HCl(pH6.8)+0.8ml甘油+0.4 ml巰基乙醇+1.6ml 10%SDS

染色液5g考馬斯亮藍(lán)加少量乙醇溶液后加水定容到100ml

脫色液：10ml甲醇+10ml95%乙醇+10ml冰乙酸加水定容到100ml

3.2試驗方法

3.2.1樣品提取

將10種番茄種子編號充分研磨后，各取0.2g放于10ml離心管中加樣品提取液室溫浸提過夜[20].

3.2.2制膠

3.2.2.1 SDS-PAGE制膠

表1 SDS-PAGE制膠配方表

3.2.2.2 A-PAGE制膠

表 2 A-PAGE制膠配方表

3.2.3 點樣與電泳

點樣量10-20μL，SDS-PAGE 10mA恒流，A-PAGE 80V穩(wěn)壓，直至溴酚藍(lán)標(biāo)記離開膠板底部.

3.2.4 染色與脫色

凝膠經(jīng)染色液染色24h，用蒸餾水沖洗后再用脫色液脫色24-48h拍照讀帶.

3.2.5 計算相對遷移率和遺傳相似系數(shù)

Rf=蛋白質(zhì)譜帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離

GS=形同譜帶數(shù)×2/總譜帶數(shù)

GD=1-GS

4 結(jié)果與分析

4.1 醇溶蛋白譜帶多樣性分析

圖1 SDS-PAGE凝膠電泳譜帶 圖2 A-PAGE凝膠電泳圖

表3 番茄遺傳多樣性GD

普通番茄與其他品種番茄之間有明顯差異(圖 1)普通番茄Rf(0.688)和Rf(0.563)特征帶，且Rf(0.688)譜帶活性強(qiáng)，櫻桃番茄屬屬于過渡類型不具有Rf(0.688)但是具有Rf(0.563)的條帶特性，本試驗中不存在野生種，所以野生種的譜帶無法進(jìn)行對比.

通過表3中可以看出所有的番茄親緣關(guān)系都比較接近，也說明了番茄種間差異較小，觀察表格可以發(fā)現(xiàn)，主要分為，櫻桃番茄和普通番茄兩類，(GD差異越小，親緣關(guān)系越近)1號(禧慶紅梨)2號(禧慶紅珠)親緣關(guān)系極近，3號(西豐粉麗)和4(白果強(qiáng)豐)號親緣關(guān)系較近，5號(黃貴妃櫻桃番茄)6號(帝皇紅櫻桃)的關(guān)系極近差異都在0.07左右 ，7號(中蔬四號)、8號(富貴嬌粉)、親緣關(guān)系很近9號(l-402太空番茄)、10號(臺灣圣美)親緣關(guān)系很近，4號(白果強(qiáng)豐)對其他品種的GD值相對偏大，但是不是很大，說明親緣關(guān)系也是很近的.從而說明了番茄中間的差異很小，分類比較復(fù)雜.

4.2 番茄品種的聚類分析

圖3 番茄遺傳差異聚類分析

對10種番茄品種醇溶蛋白間的遺傳差異進(jìn)行聚類分析，從圖 3可知，10種大番茄品種的遺傳相異系數(shù)在5.21水平上全部聚為一類，其中1號(禧慶紅梨)2號(禧慶紅珠)在1.04水平上聚為一類，說明兩者之間親緣關(guān)系很近，3號(西豐粉麗)和4(白果強(qiáng)豐)號在1.30水平上聚為一類，說明兩者關(guān)系很近，5號(黃貴妃櫻桃番茄)6號(帝皇紅櫻桃)在1.54水平上聚為一類，說明兩者關(guān)系很近，7號(中蔬四號)8號(富貴嬌粉)在1.54水平上聚為一類，說明兩者之間關(guān)系很近，9號(l-402太空番茄)10號(臺灣圣美)在1.30水平上聚為一類，說明兩者之間關(guān)系很近，3號(西豐粉麗)、4號(白果強(qiáng)豐)、5號(黃貴妃櫻桃番茄)、6號(帝皇紅櫻桃)在2.45水平上聚為一類，說明四者之間關(guān)系很較近，7號(中蔬四號)、8號(富貴嬌粉)、9號(l-402太空番茄)、10號(臺灣圣美)在2.38水平上聚為一類，說明四者之間關(guān)系很近，有6個品種1號(禧慶紅梨)、2號(禧慶紅珠)、3號(西豐粉麗)、4號(白果強(qiáng)豐)、5號(黃貴妃櫻桃番茄)、6號(帝皇紅櫻桃)在3.23水平上聚為一類，說明者六個品種之間存在一定親緣關(guān)系.

綜上所述，根據(jù)番茄的外形、顏色、蛋白質(zhì)譜帶、GD 值和聚類分析，發(fā)現(xiàn)棗莊市售的番茄品種基本上都屬于普通種番茄與櫻桃番茄屬，或者為普通番茄與櫻桃番茄的雜交種，種間差距較小，親緣關(guān)系都非常接近.

5 結(jié)論

本文通過番茄種子醇溶蛋白的電泳分析，發(fā)現(xiàn)其電泳譜帶穩(wěn)定、清晰、條帶多、重復(fù)性好，能夠反映不同物種之間的遺傳差異，可以作為親緣關(guān)系分析、遺傳育種研究的理論依據(jù).番茄種子內(nèi)間醇溶蛋白譜帶差異小，栽培品種與突變品種的譜帶基本一致，表明番茄屬醇溶蛋白譜帶相似值與親緣關(guān)系表現(xiàn)了平行性，可以作為系統(tǒng)分類的一個標(biāo)準(zhǔn).本試驗首次利用SDS-PAGE凝膠電泳，對番茄遺傳性反復(fù)研究，經(jīng)反復(fù)試驗，得出了一套適合番茄遺傳性進(jìn)行分析的定量種子的方法、凝膠濃度、電泳條件.經(jīng)對比，發(fā)現(xiàn)SDS-PAGE電泳比A-PAGE電泳譜帶更加清晰，試驗方法更加簡便快速，且分辨率高，重復(fù)性好，可作為以今后試驗的方法進(jìn)行推廣.

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UsingTwoKindsofElectrophoresisAnalysisofTomatoVarietiesGliadinandAffinity

KANG Mei-ling,TIAN Zhong-jing,XU Qing-peng

(Department of Life Science, Zaozhuang University, Zaozhuang 277160,China)

In this paper, tomato seeds tomato gliadin patterns identified the genetic relationship between the various varieties, the use of acid polyacrylamide gel electrophoresis (A-PAGE) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) on 10 kinds of commercially available tomato varieties Zaozhuang gliadin electrophoresis pattern analysis. The results showed that: different species of gliadin bands there are some differences and these differences reflect a certain relationship. 10 kinds of tomatoes isolated gliadin bands 8, most of them have the same five bands, a small part of the small number of bands, at least four bands, through genetic similarity and genetic diversity of tomato genetic relationship, after cluster analysis of genetic diversity, the 10 kinds of tomatoes at a certain level, clustered into five categories. Tomato varieties of Zaozhuang kinship analysis, and provide a basis for genetic breeding.

tomato;gliadin;electrophoresis;A-PAGE; SDS-PAGE

QZ91

A

1004-7077(2013)05-0127-06

2013-08-10

康美玲(1977-)，女，山西運城人，棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院講師，理學(xué)碩士，主要從事生物化學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)方面的研究.

胡勤忠]