朱桂云 楊永輝 安曉穎 康麗菲 陳寧 歐陽琴

我國是結核病高發(fā)國家之一，每年新增結核病患者約150萬。在結核病防治中，我們面臨的最大難題之一就是如何快速準確地診斷結核。γ-干擾素釋放試驗是一種新的診斷結核的輔助手段，因其具有較高的敏感性和特異性，已受到臨床越來越廣泛的重視［1］。目前有兩種較為成熟的γ-干擾素釋放試驗方法，即酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)［2，3］，本研究選用分別采用這兩種方法的結核桿菌特異性細胞免疫反應(A.TB)試劑盒和結核感染T 細胞斑點試驗(TSPOT.TB)試劑盒進行γ-干擾素釋放試驗，對比研究檢測結果的一致性，探討二者的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料隨機選取2012 年1 至6 月初次在我院住院的臨床診斷為肺結核和待排除肺結核的患者70 例，其中男38例，女32 例;年齡22 ～53 歲，平均年齡37.6 歲。70 例患者中有44 例確診為肺結核(以痰涂片發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌或結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性為標準)，剩余的26 例均為排除肺結核的診斷，其中普通細菌感染引起的肺炎19 例，肺癌4 例，間質性肺炎2例，結節(jié)病1 例。

1.2 儀器與試劑CO2培養(yǎng)箱，水浴鍋，酶標儀。T-SPOT.TB試劑盒(英國Oxford Immunotec Ltd 生產(chǎn))，A.TB 試劑盒(海口維瑅璦生物研究院生產(chǎn))，RPMI1640 培養(yǎng)液，PBS 緩沖液，AIMV 培養(yǎng)液，淋巴細胞分離液。

1.3 方法

1.3.1 T-SPOT.TB 檢測:①外周血單個核細胞的分離、收集與計數(shù):每個入選病例采集4 ml 外周血標本置于肝素鋰抗凝的試管中，立即混勻，在4 h 內(nèi)進行PMBC 分離。即加入等體積的RPMI1640 培養(yǎng)液混勻后緩慢加在4 ml 淋巴細胞分離液上層，2 500 r/min水平離心22 min 后吸取中間層云霧狀細胞(PMBC)。在PMBC 中加入RPMI 1640 至10 ml，1 900 r/min 水平離心7 min，棄去上清液。加入 AIM-V 培養(yǎng)液至10 ml，1 700 r/min水平離心7 min，棄去上清液。進行顯微鏡下細胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結果用AIM-V 調(diào)節(jié)剩余細胞懸液濃度至2.5×106/ml。②體外抗原刺激與孵育:取出試劑盒中的微孔板，1 份標本需4 個孔，分別加入陰性對照AIM-V、抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)、陽性對照植物凝集素PHA 各50 μl，然后在每孔中加入細胞懸液各100 μl，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 ～20 h 后用PBS 緩沖液洗板4 次，加入新鮮稀釋的酶標記單抗50 μl，2 ～8℃孵育1 h 后再用PBS 緩沖液洗板4 次，每孔加入顯色底物50 μl，避光室溫靜置7 min 后用蒸餾水沖洗觀察結果，用顯微鏡計數(shù)每個孔中的斑點。③結果判定:陰性對照孔斑點數(shù)為0 ～5 個，抗原A 和抗原B 檢測孔任一孔計數(shù)－陰性孔計數(shù)≥6 判為陽性;如果陰性對照孔斑點數(shù)≥6，檢測孔斑點數(shù)≥2 倍陰性孔斑點數(shù)判為陽性。

1.3.2 A.TB 檢測:①全血刺激:每個入選病例采集3 ml 外周血標本置于肝素鋰抗凝的試管中，立即混勻，16 h 內(nèi)進行刺激。刺激時每個病例需取3 個無抗凝劑采血管做為反應管，陰陽性對照管分別加入陰性刺激劑20 μl、陽性刺激劑20 μl，測試管加入刺激劑1(ESAT-6)10 μl 和刺激劑2(CFP-10)10 μl;之后每個采血管中各加入1 ml 充分混勻的全血，蓋緊蓋子劇烈晃動直至有泡沫出現(xiàn)，然后立即直立向上置于37℃的水浴箱中孵育22 ～24 h。②制備標準曲線及進行γ-干擾素檢測:按說明配制6 個不同濃度的標準品，濃度為0.156 ～5 U/ml。加樣:取出試劑盒中的酶標板，取6 種不同濃度的標準品及樣品稀釋液各100 μl 以復孔形式加入酶標板孔中;每個樣品檢測孔中加入樣品稀釋液及待測樣品各50 μl;置37℃水浴箱中孵育1 h。用配好的洗滌液洗板5 次，拍干后每孔加入100 μl配好的檢測抗體工作液，置37℃水浴箱中孵育30 min。再用洗滌液洗板5 次，拍干后每孔加入100 μl 親和素-辣根過氧化物酶工作液，置37℃水浴箱中避光孵育30 min。用洗滌液洗板5 次后加入酶作用底物100 μl(底物A 與底物B 各50 μl 充分混勻)，37℃水浴箱中避光孵育10 min，然后每孔加入100 μl 終止液，5 min 內(nèi)用酶標儀讀取450 nm 處的OD 值。③標準曲線的繪制及及結果判定:應用Microsoft office Excel 軟件，以標準曲線各點濃度的自然對數(shù)(LN)作為橫坐標X，OD 均值的自然對數(shù)作為縱坐標Y，做XY 散點圖，添加趨勢線，得到標準曲線方程Y=aX+b及其線性相關系數(shù)R2。分別取樣品的N(陰性對照)、T(檢測)OD 值的自然對數(shù)Y、P(陽性對照)值，然后將其代入上述標準曲線方程求得各自對應的X 值，再分別求反對數(shù)后乘以稀釋倍數(shù)2，得到N、P 和T 三個濃度值，最后以P 值和T 值分別減去N 值，得到(P－N)和(T－N)值。當N ＜0.5 U/ml 時，(TN)/(P－N)≥0.60 時判為陽性，否則為陰性;當N≥0.5 U/ml時，(T－N)/(P－N)≥0.85 時判為陽性，否則為陰性。

1.4 統(tǒng)計學分析 將兩種方法測出的結果進行比較，分析其一致性用McNemar 檢驗，一致性強度采用κ 系數(shù)表示，κ ＞0.4表示兩者一致性較好，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

44 例結核病患者A.TB 檢測為陽性的有40 例，敏感性90.9%;T-SPOT.TB 檢測為陽性的有41 例，敏感性93.2%。26例非結核病患者A.TB 檢測陰性的為23 例，特異性為88.5%，T-SPOT.TB 檢測陽性的為24 例，特異性為92.3%。兩種檢測方法相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)，檢測一致性也較強(κ=0.819)，兩者的敏感性也較一致(P =1.000，κ=0.535)，但T-SPOT.TB 的特異性稍強于A.TB(P=1.000，κ=0.339)。見表1。

表1 A.TB 與T-SPOT.TB 兩試驗方法診斷效能一致性分析

3 討論

結核病的早期快速診斷已經(jīng)成為制約結核病控制的關鍵因素。目前，常規(guī)結核病實驗室檢測方法診斷陽性率不到60%。為克服傳統(tǒng)痰涂片、痰培養(yǎng)及結核菌素試驗等檢測方法的不足，近年來發(fā)展的以T 細胞免疫應答為基礎的γ-干擾素釋放試驗，采用ELISA 或ELISPOT(酶聯(lián)免疫吸附/酶聯(lián)免疫斑點)方法定量檢測全血/外周血單核細胞在結核菌特異性抗原刺激下釋放γ-干擾素的水平，用于診斷潛伏性結核分枝桿菌感染以及結核病，比結核菌素試驗有更高的敏感性與特異性［4］。其原理是機體受到結核分枝桿菌感染后產(chǎn)生的記憶性T 細胞，在再次受到結核分枝桿菌特異性抗原刺激時會釋放γ 干擾素，可以在體外對釋放的γ 干擾素水平或能有效釋放γ 干擾素的T 細胞進行定量，從而判斷機體是否結核分枝桿菌的感染者。目前有兩種較為成熟的γ-干擾素釋放分析技術，即QFT-G 試驗(cellestis incorporated，carnegie，Australia)和T-SPOT.TB 試驗(Oxford Immunotec，Abingdon，UK)。其對應的方法和試劑盒先后被美國FDA 批準應用于臨床，CDC 為其指定了使用指南。本研究所采用的A.TB 試劑盒是以QFT-G 試驗為基礎發(fā)展而來的，是利用酶聯(lián)免疫法檢測分泌的γ 干擾素的量;而T-SPOT.TB試劑盒是利用酶聯(lián)免疫斑點法檢測分泌γ 干擾素的淋巴細胞數(shù)量。以往的研究中，采用的都是進口的T-SPOT.TB 試劑盒，A.TB 試劑盒做為新研制出來的一種國產(chǎn)試劑盒，目前在國內(nèi)的應用較少，本研究將兩種試劑盒做對比研究，發(fā)現(xiàn)其檢測效能具有較高的一致性(P ＞0.05，κ ＞0.4)，表明A.TB 試劑盒和T-SPOT.TB 試劑盒一樣，也可以作為臨床上診斷結核比較可靠的一種輔助手段。

本研究中T-SPOT.TB 試劑盒的檢測敏感性為93.2%，特異性為92.3%，這與前人的研究相符，也證實T-SPOT.TB 的確可以作為輔助檢測結核菌感染的有效手段。通過對比檢測結果，我們發(fā)現(xiàn)A.TB 試劑盒的敏感性和特異性也很高，這可能與A.TB 采用新的方法制作刺激抗原有關。γ-干擾素釋放試驗試劑盒中最關鍵的部分是ESAT-6 和CFP-10 抗原，目前QFT-G和T-SPOT.TB 的試劑盒主要以這兩種抗原為基礎［5］。ESAT-6和CFP-10 的蛋白編碼來源于結核分枝桿菌基因中的一個菌種特異性基因片斷，稱為region of difference l(RDI)。這個基因片斷不存在于大部分的非結核分枝桿菌以及所有的牛型分枝桿菌(包括卡介苗)中，因此ESAT-6 和CFP-10 作為抗原具有較高的特異性。雖然A.TB 試劑盒和T-SPOT.TB 試劑盒都采用ESAT-6 和CFP-10 作為刺激抗原，但具體的組成卻有很大的差異。A.TB 在制作刺激抗原時使用了一種新的抗原投遞系統(tǒng)作為分子注射器，用的是經(jīng)修飾的基因工程組ESAT-6 及CFP-10 全長蛋白，T-SPOT.TB 采用的刺激抗原是ESAT-6 和CFP-10 的肽段組合。全長的ESAT-6 和CFP-10 抗原可以最大限度地遞呈抗原中的影藏表位和不同免疫優(yōu)勢的表位，激活更廣泛的T 細胞進行響應，同時又具有抗原質量穩(wěn)定的優(yōu)勢。這在很大程度上提高了A.TB 試劑盒的特異性和敏感性。

除了檢測效能一致外，兩個試劑盒各有特點，T-SPOT.TB試劑盒在國內(nèi)的研究及應用較多，方法成熟，結果判讀直觀，但成本較高，需提取淋巴細胞并培養(yǎng)，培養(yǎng)前操作步驟較多，較易受到污染，比較適合實驗室條件好，醫(yī)療條件高的大型醫(yī)院;A.TB 試劑盒成本較低，用血量少，加入刺激劑后直接全血孵育，操作簡單不易污染，又節(jié)省了培養(yǎng)液，但操作過程稍復雜，需要做標準曲線進行質控，較適合基層醫(yī)院和大規(guī)模普查。此外T-SPOT.TB試劑盒還有用于胸腹水、肺泡灌洗液中結核桿菌感染檢測的報導，但A.TB 試劑盒目前還只能用于檢測全血樣本。

綜上，每個實驗室可以根據(jù)自己的實際情況選擇其中一種方法為臨床提供及時可靠的檢測報告。

1 Meier T，Eulenbruch HP，Wrighton-Smith P，et al.Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay(T SPOT-TB)for diagnosis of tuberculosis in clinical practice.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2005，24:529-536.

2 Mazurek GH，Jereb J，Lobue P，et al.Guidelines for using the QuantiFERON-TB Gold test for detecting Mycobacterium tuberculosis infection，United States.MMWR Recomm Rep，2005，54:49-55.

3 Lalvani A.Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century:new tools to tackle an old enemy.Chest，2007，131:1898-1906.

4 吳妹英，王霞芳，肖玉梅，等.酶聯(lián)免疫斑點法在快速診斷活動性肺結核中的應用.中華實驗和臨床感染病雜志，2009，5:1-4.

5 Madhukar P，Lee WR，John M，et al.Interferon-γassays in the immunodiagnosis of tuberculosis:a systematic review.Infectious Diseases，2004，4:761-773.