姜濤 蔣序 張運(yùn)奎

[摘要] 目的 檢測(cè)一個(gè)顱鎖骨發(fā)育不全綜合征（CCD）家系RUNX2基因突變情況。方法 采用先證者查證法，對(duì)CCD家系各成員進(jìn)行全身健康狀況及口腔?？茩z查，拍攝X線片；抽取先證者及其父母、姐姐外周靜脈血，提取基因組DNA，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增RUNX2基因并測(cè)序，將先證者及其父母、姐姐RUNX2基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blastn比較分析。結(jié)果 在先證者RUNX2基因的外顯子2上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)C→T突變，此突變來自母系染色體該基因568位點(diǎn)的基因突變；密碼子CGG→TGG引起RUNX2編碼的轉(zhuǎn)錄因子第190位保守的精氨酸變成色氨酸，突變型為c.568C>T。結(jié)論 c.568C>T突變是導(dǎo)致該家系發(fā)病的分子基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 顱鎖骨發(fā)育不全綜合征； RUNX2； 基因突變

[中圖分類號(hào)] R 781.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.019

顱鎖骨發(fā)育不全綜合征（cleidocranial dyspla-sia，CCD）是一種累及骨骼和牙齒的常染色體顯性遺傳性疾病[1]，具有明顯的家族聚集性，男女發(fā)病率無明顯差別，臨床發(fā)病率約為1：1 000 000。CCD常見的臨床癥狀有囟門閉合延遲或不閉合，顱骨縫增寬，鎖骨鈣化不良、缺失或部分缺失，錐形胸，恥骨聯(lián)合增寬而致骨盆發(fā)育不良，身材矮小等；口腔表現(xiàn)常見上頜骨發(fā)育不足，有多生牙，乳牙滯留，恒牙萌出延遲或埋伏牙等癥狀[2-5]。目前CCD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，本研究采用分子生物學(xué)的方法對(duì)1個(gè)顱鎖骨發(fā)育不全家系的患者進(jìn)行RUNX2基因測(cè)序分析研究。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

CCD家系1個(gè)，來自山東省濟(jì)南市，家系圖見圖1。先證者，女，29歲，2010年6月因“牙齒不齊，咀嚼困難”到濟(jì)南市口腔醫(yī)院修復(fù)科就診，要求修復(fù)上下牙列缺損。采用先證者查證法，對(duì)家系各成員進(jìn)行全身健康狀況及口腔?？茩z查。查體：先證者反，混合牙列，恒牙僅16、17、26、27、36、37、46萌出，全部乳牙均滯留，11～15、21～25、31～

35、41～45未萌，65、71、72、73、75、81、82、83、85松動(dòng)Ⅱ度；顱骨和面部比例失調(diào)，頭大面小，前額及頂部突出呈方形，前囟門未閉合，從額部到枕部中線區(qū)有明顯凹陷；面中部發(fā)育不足，凹面型，眶距增寬；上頜骨及顴骨發(fā)育不足，下頜骨發(fā)育相對(duì)正常；肩部窄小，胸部呈圓錐形，鎖骨短小，僅在近胸骨處可捫及，雙肩下垂并可在胸前并攏。X線（圖2）檢查：上下頜骨內(nèi)有埋伏牙，滯留乳牙牙根未見明顯吸收，前囟門未閉合，顱縫增寬，并見多塊縫間骨，雙側(cè)肩胛骨較小，呈翼狀，位置下垂，雙側(cè)鎖骨肩峰端部分缺如，恥骨聯(lián)合間隙增寬，骶髂關(guān)節(jié)輕度增寬。先證者及其母親的臨床表現(xiàn)和X線特征均符合CCD特征。該家系中3代共15位成員，其中CCD患者2例：先證者及其母親，其母親自述先證者姥姥、姥爺和其兄弟姐妹無類似癥狀。

箭頭所指為先證者，Ⅰ～Ⅳ代表代數(shù)。

圖 1 患者家族譜系圖

Fig 1 The pedigree of the involved family

1.2 基因組DNA提取及測(cè)序ⅡⅢ

1.2.1 DNA提取 抽取先證者及其父母、姐姐外周靜脈血各2 mL，放入干冰凍存，使用Universal Ge-nomic DNA Extraction Kit試劑盒進(jìn)行DNA 提取，取 1 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得基因組DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[6]的方法設(shè)計(jì)7對(duì)寡核苷酸引物（表1），然后對(duì)RUNX2 基因分別使用TaKaRa LA Taq?、TaKaRa MightyAmp DNA Polymerase?進(jìn)行套式PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系及方法按照說明書進(jìn)行。

1.2.3 基因測(cè)序及突變位點(diǎn)分析 使用TaKaRa Aga-rose Gel DNA Purification Kit切膠回收目的片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由寶生物工程（大連）有限公司完成，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blastn比較分析。

2 結(jié)果

將先證者的RUNX2基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blastn比較分析，在Exon 2上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)C→T突變，實(shí)際測(cè)序圖譜顯示雙峰結(jié)構(gòu)（C、T）；對(duì)于其CCD母親的基因檢測(cè)結(jié)果表明，此突變來自母系染色體該基因568位點(diǎn)的基因突變；密碼子CGG→TGG可能引起RUNX2編碼的轉(zhuǎn)錄因子第190位（R190W）保守的精氨酸變成色氨酸。該突變型為c.568C>T，CGG>

TGG。先證者的父親、姐姐的測(cè)序結(jié)果顯示，在同一位點(diǎn)顯示C的單峰，即與Blastn中健康人的序列相同（圖3）。

3 討論

目前的研究表明，顱鎖骨發(fā)育不全的致病基因是RUNX2，該基因定位于染色體6p21[7-8]，基因的錯(cuò)意表達(dá)、基因插入、缺失或者移碼突變等都是造成顱鎖骨發(fā)育不全綜合征的重要原因[9]。

鎖骨顱骨發(fā)育不全呈常染色體顯性遺傳，有很高的外顯率和不同的表現(xiàn)型，輕癥僅有牙齒異常，嚴(yán)重者表現(xiàn)為全身骨質(zhì)受累[2]。本研究家系中母女兩人受累，家系其他成員表型正常，考慮基因突變?yōu)橥话l(fā)性，突發(fā)后呈常染色體顯性遺傳。

鎖骨顱骨發(fā)育不全的致病基因RUNX2是哺乳動(dòng)物編碼轉(zhuǎn)錄因子PEBP2/CBF異二聚體d亞單位的

3個(gè)基因之一，此α亞單位包含了有結(jié)合DNA能力的128個(gè)氨基酸殘基，并且這一結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中為保守區(qū)域，與果蠅的runt區(qū)域具有較高的同源性，因而得名[6]。

研究發(fā)現(xiàn)RUNX2基因敲除小鼠模型沒有骨組織和成骨細(xì)胞，這表明該轉(zhuǎn)錄因子為成骨細(xì)胞分化所必需，其在維持正常的骨骼生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用[10-11]。RUNX2基因突變存在熱點(diǎn)區(qū)域，該基因外顯子1、2、3、5、7編碼蛋白質(zhì)的3個(gè)重要功能域：谷氨酸-丙氨酸富集區(qū)（QA功能域）、runt功能域和脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸富集區(qū)（PST功能域）[12-14]。本研究檢測(cè)到的R190W突變發(fā)生在RUNX2中，位于runt功能域內(nèi)，這個(gè)堿基改變將導(dǎo)致位于runt 結(jié)構(gòu)域中第190 位保守的精氨酸編碼為色氨酸（R190W）。在runt區(qū)域中的精氨酸拉伸物對(duì)DNA的結(jié)合有重要作用，因此，這個(gè)區(qū)域的破壞可以導(dǎo)致DNA結(jié)合能力的喪失[13]，精氨酸側(cè)鏈?zhǔn)荄NA結(jié)合的主要區(qū)域，當(dāng)被不同的疏水性的色氨酸代替后，干擾了runt區(qū)域的結(jié)構(gòu)，降低了DNA的結(jié)合能力。2001年Berg-witz等[15]首次報(bào)道了這個(gè)突變位點(diǎn)，本研究結(jié)果則進(jìn)一步證實(shí)了RUNX2中的R190W錯(cuò)義突變?yōu)镃CD的致病突變，推測(cè)R190W（c.568C>T）為一個(gè)突變熱點(diǎn)。

典型CCD一般根據(jù)患者的典型面容、咬合關(guān)系、X線片檢查以及全身情況即可診斷，X線檢查方法為確診本病的主要手段。由于CCD的X線征象具有特殊性，所以診斷并不困難，關(guān)鍵在于是否能想到本病。但對(duì)于輕癥特別是僅有牙齒萌出異?；颊叩呐R床診斷較困難，通過檢測(cè)RUNX2是否存在突變位點(diǎn)可以輔助診斷CCD。由于本病目前尚無確切有效的治療手段且外顯率高，即使檢測(cè)基因發(fā)現(xiàn)有突變位點(diǎn)也并無好的治療方法，因此CCD患者愿意進(jìn)行抽血基因檢測(cè)的比例很少。盡管目前已有80～90個(gè)RUNX2不同的突變位點(diǎn)被報(bào)道，約500個(gè)獨(dú)立的CCD患者家族經(jīng)過突變檢測(cè)的篩選，但是此疾病致病基因的篩選和驗(yàn)證分析工作仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，新基因位點(diǎn)的鑒定將保證進(jìn)一步的系統(tǒng)突變分析工作的開展，這可以為探討CCD致病機(jī)制的分子遺傳學(xué)機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。對(duì)于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CCD患者應(yīng)進(jìn)行遺傳咨詢，通過產(chǎn)前診斷及時(shí)發(fā)現(xiàn)攜帶有致病基因的胎兒[16]。

目前對(duì)CCD并無確切有效的治療方法。對(duì)于處于生長(zhǎng)發(fā)育期的患者可以采用正畸的方法進(jìn)行治療，必要時(shí)拔除滯留乳牙，減小恒牙萌出的阻力，或者采用牽引的辦法幫助恒牙萌出；對(duì)于骨缺損導(dǎo)致的鼻梁塌陷等，可采用整形外科手術(shù)的方法進(jìn)行骨移植，恢復(fù)患者的容貌；對(duì)于缺失牙齒，可采用種植或活動(dòng)義齒等修復(fù)方法來進(jìn)行修復(fù)。總之，對(duì)于CCD患者需要多學(xué)科聯(lián)合修復(fù)治療，長(zhǎng)期的臨床效果尚需要進(jìn)一步觀察。

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（本文編輯 李彩）