馬文衡 劉麗敏 王 永 徐超慧 趙淑華

中國(guó)石油華北油田分公司 采油工程研究院（河北 任丘 062552）

在油氣生產(chǎn)系統(tǒng)中存在著硫酸鹽還原菌（SRB）、腐生菌（TGB）、鐵細(xì)菌（IB）等菌類，對(duì)生產(chǎn)系統(tǒng)產(chǎn)生了較強(qiáng)的腐蝕、污染注水水質(zhì)等不良影響。為了控制菌類的繁殖，常采用殺菌劑或其他物理方式滅菌，這些工作及效果分析需要進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量的測(cè)試。我國(guó)石油行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SY/T 5329-2012《碎屑巖油藏注水水質(zhì)指標(biāo)及分析方法》 以及SY/T 0532-2012《油田注入水細(xì)菌分析方法 絕跡稀釋法》中已經(jīng)建立了細(xì)菌數(shù)量的分析方法[1，2]。1975 年，美國(guó)石油學(xué)會(huì)（API）出版了API RP 38《油田注入水細(xì)菌分析推薦作法》[3]，之后不斷修訂，到2004 年API 選擇美國(guó)腐蝕工程師學(xué)會(huì)（NACE）的NACE 標(biāo)準(zhǔn)TM 0194-2004 作為其推薦標(biāo)準(zhǔn)，即《油氣系統(tǒng)中細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》[4,5]。通過(guò)對(duì)TM 0194-2004、SY/T 5329-2012 和SY/T 0532-2012 中的細(xì)菌現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)方法的比較研究和試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在取樣方法、細(xì)菌培養(yǎng)、結(jié)果報(bào)告等方面的差異對(duì)分析結(jié)果有較大影響。

1 取樣方法

1.1 有效取樣是成功分析的基礎(chǔ)

標(biāo)準(zhǔn)TM 0194-2004 中對(duì)取樣做了專門規(guī)定，而且將浮游菌和固著菌分開取樣，并指出在系統(tǒng)中的流動(dòng)水中取樣只能取得浮游菌的有效樣而不能取得固著菌的；固著菌的試樣要從取樣試片上刮下或從濾料反洗水中取，也可以在清管器清管時(shí)取，或在管壁刮取粘附菌樣。

在TM 0194-2004 標(biāo)準(zhǔn)中詳細(xì)敘述了浮游菌的采樣程序，包括采樣頻度，對(duì)取樣瓶的要求，涉及取樣中出現(xiàn)的各種問(wèn)題的處理等。

SY/T 5329-2012 和SY/T 0532-2012 對(duì)固著菌和浮游菌均沒(méi)有提出取樣要求。

1.2 對(duì)取樣方法的討論

為使分析結(jié)果能說(shuō)明系統(tǒng)的實(shí)際狀況，所取樣品的代表性至關(guān)重要。在油氣系統(tǒng)中，危害生產(chǎn)較為嚴(yán)重的SRB 實(shí)際上是一種固著菌，按浮游菌特性采樣不能真實(shí)反映系統(tǒng)中SRB 的實(shí)際生長(zhǎng)情況。NACE TM 0194-2004 中規(guī)定SRB 采樣按照固著菌方法進(jìn)行。盡管該標(biāo)準(zhǔn)在采樣上做出了相應(yīng)的規(guī)定，但在這一標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)固著菌的取樣規(guī)定仍不夠明確。例如，用掛片法測(cè)固著菌數(shù)量，掛片時(shí)間多長(zhǎng)為宜，掛片面積與細(xì)菌數(shù)量的結(jié)果表示是怎樣的等在文中并未敘述，仍然需要作進(jìn)一步研究。如果取濾罐反洗水時(shí)，什么時(shí)間取樣（開始、中間、結(jié)束）、什么樣的反洗條件（一般水洗還是加清洗劑）等諸多問(wèn)題也需要研究。

2 細(xì)菌培養(yǎng)

2.1 培養(yǎng)基的制備和接種

TM 0194-2004 給出測(cè)試瓶法。對(duì)人工配制培養(yǎng)基的條件給出明確要求，不同菌應(yīng)用不同配方，對(duì)好氧菌和嚴(yán)格厭氧菌要在不同控氧條件下制備培養(yǎng)基和接種。培養(yǎng)基的鹽的組分和濃度應(yīng)與現(xiàn)場(chǎng)的水質(zhì)接近，其濃度偏差在10%以內(nèi)，還指出只有液體培養(yǎng)基適用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試。詳細(xì)敘述了材料配方和液體培養(yǎng)基的制備程序以及接種程序。

SY/T 5329-2012 和SY/T 0532-2012 給出了 測(cè)試瓶法，對(duì)不同菌種要求不同培養(yǎng)基，但無(wú)配方，沒(méi)有SRB 培養(yǎng)基制備和接種時(shí)的環(huán)境（如惰性氣體）條件要求，也無(wú)培養(yǎng)基鹽份和鹽濃度的要求，無(wú)培養(yǎng)瓶的制備程序。

2.2 細(xì)菌的培養(yǎng)與檢測(cè)

TM 0194-2004 對(duì)各種菌要求在現(xiàn)場(chǎng)取樣時(shí)記錄的溫度±5℃條件下培養(yǎng)。TGB 培養(yǎng)14 天，在1～14天內(nèi)變色（或變濁）的記為“+”（陽(yáng)性）。SRB 的培養(yǎng)如果在2h 內(nèi)變黑應(yīng)視為水樣中硫化物引起的，不能計(jì)數(shù)。如果28 天后僅有1 瓶變黑應(yīng)再培養(yǎng)。在新培養(yǎng)基內(nèi)可培養(yǎng)7 天，但備份樣仍需培養(yǎng)28 天。一般培養(yǎng)為28 天，變黑記為“+”。

SY/T 5329-2012 要求在現(xiàn)場(chǎng)水溫±5℃內(nèi)培養(yǎng)，7 天后讀數(shù)。

SY/T 0532-2012 要求在35℃條件下培養(yǎng)，TGB培養(yǎng)7 天，紅變黃或變濁為“+”；SRB 培養(yǎng)14 天，變黑為“+”；IB 培養(yǎng)7 天，變濁或紅棕色沉淀為“+”。

2.3 對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的討論

NACE TM 0194-2004 適用于油氣系統(tǒng)的細(xì)菌現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試，要求培養(yǎng)基與現(xiàn)場(chǎng)的相應(yīng)條件盡可能一致。培養(yǎng)基配方至關(guān)重要，所以給出配方。

SY/T 5329-2012 和SY/T 0532-2012 中均無(wú) 細(xì)菌培養(yǎng)瓶的制備規(guī)定，既無(wú)培養(yǎng)基配方，也無(wú)制備規(guī)程，怎樣保證培養(yǎng)瓶的質(zhì)量值得注意。

關(guān)于被測(cè)系統(tǒng)的水中鹽組分及其濃度對(duì)細(xì)菌測(cè)試結(jié)果的影響，國(guó)內(nèi)目前尚未查到相關(guān)報(bào)導(dǎo)，但培養(yǎng)溫度對(duì)其影響很大（表1）。

從表1 可以看出，溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響很大，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試應(yīng)以接近現(xiàn)場(chǎng)溫度更合理。SY/T 0532-2012即使在實(shí)驗(yàn)室用35℃培養(yǎng)來(lái)評(píng)價(jià)殺菌劑，其結(jié)果也不能反映實(shí)際情況，給出的結(jié)果也是不對(duì)的。

關(guān)于培養(yǎng)時(shí)間幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)都不一致。通過(guò)對(duì)5 個(gè)采油廠的14 個(gè)水樣中SRB 的培養(yǎng)觀察，結(jié)果表明，在適宜條件下，培養(yǎng)7 天進(jìn)行計(jì)數(shù)可得最大菌數(shù)[6]。7 天能給出有效結(jié)果省時(shí)省力，最好。但相類似的國(guó)標(biāo)對(duì)SRB 的培養(yǎng)時(shí)間要求仍為21 天[7,8]，對(duì)IB 的培養(yǎng)時(shí)間要求仍為14 天，所以培養(yǎng)時(shí)間為7 天是否可靠，應(yīng)進(jìn)行更深入試驗(yàn)研究。

3 結(jié)果報(bào)告

3.1 計(jì)數(shù)

TM 0194-2004 對(duì)于不同情況給出了不同的細(xì)菌培養(yǎng)方法和結(jié)果計(jì)數(shù)。簡(jiǎn)單的估計(jì)細(xì)菌數(shù)量范圍可以采用一組序列稀釋細(xì)菌測(cè)試瓶培養(yǎng)，即將一組培養(yǎng)基測(cè)試瓶編號(hào)按順序排列，1mL 水樣注入1 號(hào)瓶混均勻后抽取1mL 注入2 號(hào)瓶，混勻后再抽取1mL 注入3 號(hào)瓶，依次序稀釋。培養(yǎng)后觀察細(xì)菌情況，根據(jù)生長(zhǎng)菌瓶序號(hào)報(bào)告細(xì)菌量估計(jì)值，如表2 所示。

單列培養(yǎng)瓶所報(bào)的估計(jì)值很粗，但標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為油田也是可以接受的。作為推薦作法，應(yīng)采用雙平行序列稀釋，即用兩個(gè)平行序列培養(yǎng)組，同時(shí)接種并培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)“+”瓶號(hào)及菌數(shù)估計(jì)范圍如表2 所示。

SY/T 5329-2012 也采用序列稀釋法，細(xì)菌計(jì)數(shù)推薦采用三列重復(fù)法，也可以采用二列重復(fù)法。其統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)如表3 所示（這里只列稀釋法二列重復(fù)細(xì)菌計(jì)數(shù)表，例如，生長(zhǎng)指標(biāo)101 表示兩列中1 號(hào)瓶中有一個(gè)“+”，2 號(hào)瓶中2 個(gè)“—”，3 號(hào)瓶中有一個(gè)“+”）。

SY/T 0532-2012 的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法與SY/T5329-2012 基本相同，此處不再討論。

表1 不同溫度細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果比較表

表2 培養(yǎng)瓶細(xì)菌數(shù)估計(jì)值

表3 稀釋法二列重復(fù)細(xì)菌計(jì)數(shù)表

3.2 關(guān)于結(jié)果報(bào)告的分析討論

TM 0194-2004 的單序列培養(yǎng)瓶法細(xì)菌計(jì)數(shù)過(guò)于簡(jiǎn)單；雙平行序列培養(yǎng)瓶法的統(tǒng)計(jì)表（表2）在實(shí)際操作中并非兩列瓶的“+”號(hào)瓶數(shù)總是一致的，因此不實(shí)用。實(shí)際現(xiàn)場(chǎng)取樣培養(yǎng)的結(jié)果更多的是SY/T 5329-2012 中的雙平行序列稀釋法，因此，給出的情況按表3（SY/T 5329-2012 中表4，表5）的統(tǒng)計(jì)細(xì)菌計(jì)數(shù)更為合理。對(duì)于SY/T 5329-2012 所推薦的三平行序列稀釋法應(yīng)視具體情況定。一般的水質(zhì)檢測(cè)二平行序列稀釋法精度也能滿足要求。對(duì)于TM 0194-2004 中提出的5 平行序列稀釋，只有當(dāng)要求較精確的測(cè)定時(shí)才宜選用。

4 結(jié)論

（1）對(duì)石油生產(chǎn)中水系統(tǒng)的細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)的國(guó)內(nèi)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與美國(guó)API 推薦的NACE 相同標(biāo)準(zhǔn)比較，后者更注重取樣的現(xiàn)場(chǎng)條件和樣品的代表性及準(zhǔn)確性，因此，對(duì)取樣要求更詳細(xì)，特別提出了浮游菌和固著菌分別取樣的要求。雖然固著菌取樣程序尚需進(jìn)一步研究完善，但要求是符合實(shí)際的。

（2）培養(yǎng)基接種和培養(yǎng)條件是細(xì)菌培養(yǎng)的關(guān)鍵內(nèi)容。API 推薦的NACE 標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)TGB、SRB 都給出了相關(guān)的培養(yǎng)基配方、接種和培養(yǎng)操作規(guī)程，可以保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。這種作法與我國(guó)的相關(guān)國(guó)標(biāo)一致。前述兩個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)培養(yǎng)基配方，也沒(méi)有培養(yǎng)瓶的制作要求和操作規(guī)程。使用單位不知道或無(wú)法檢查培養(yǎng)瓶是否為合格產(chǎn)品，給質(zhì)量控制增加了難度。培養(yǎng)時(shí)間一律為7 天是否科學(xué)，有待進(jìn)一步研究。

（3）采樣操作應(yīng)以TM 0194-2004 為基礎(chǔ)，完善固著菌的采樣規(guī)程。培養(yǎng)基的配方和培養(yǎng)瓶制備要求可參照TM 0194－2004 以及相關(guān)的我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中給出。細(xì)菌和培養(yǎng)條件是接近現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)際情況。結(jié)果報(bào)告應(yīng)主要參照SY/T 5329-2012 的規(guī)定執(zhí)行，一般采用二平行序列稀釋法就可以滿足油田監(jiān)測(cè)要求，要求較精確的可采用稀釋三平行或四平行等序列。

[1]SY/T5329-2012 碎屑巖油藏注水水質(zhì)指標(biāo)及分析方法[S].

[2]SY/T0532-2012 油田注入水細(xì)菌分析方法 絕跡稀釋法[S].

[3]API RP38 Recommended Practice for Biological Analysis of Waterflood injection Waters[S].

[4]NACE TM 0194-2004 Field Monitoring of Bacterial Growth in Oil and Gas Systems[S].

[5]SY/T5523-2006 油田水分析方法[S].

[6]賈翠英,于亞蘭.油田注入水中硫酸鹽還原菌計(jì)數(shù)的最佳生長(zhǎng)期[J].微生物學(xué)通報(bào),1995(3)：158-159.

[7]GB/T 14643.5-2009 工業(yè)循環(huán)冷卻水中菌藻的測(cè)定方法第5 部分硫酸鹽還原菌的測(cè)定MPN 法[S].

[8]GB/T 14643.6-2009 工業(yè)循環(huán)冷卻水中菌藻的測(cè)定方法第6 部分鐵細(xì)菌測(cè)定MPN 法[S].