張雁南，劉 剛，宋文爽

（吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林長春 130052）

黃酮類化合物(Falconoid)，又稱生物類黃酮(Bioflavoniod)，早期是指具有乙-苯基吡喃酮結(jié)構(gòu)的一類黃色素，現(xiàn)指具有色酮環(huán)與苯環(huán)為基本結(jié)構(gòu)的一類化合物的總稱[1]。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，是植物長期自然選擇過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[2]。黃酮類化合物具有抗氧化[2]、抗腫瘤[2]、抗糖尿病及其并發(fā)癥[2]、抗病毒[1]等多種生物活性。黃酮類化合物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域，在食品中的可用作抗氧化劑、甜昧劑等[2]，醫(yī)藥方面用于開發(fā)抗心血管病藥物、抗肝臟毒素藥、止咳平喘藥等[1]。

水紅花子為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)桃葉蓼組植物紅蓼Polygounum orientale L.的干燥成熟果實[3]。藥理研究報道水紅花子具有抗腫瘤、抑菌、利尿作用，現(xiàn)代臨床新用治療肝硬化、乙型肝炎、抗凝血[3]。水紅花子主要含有槲皮素、花旗松素等數(shù)種黃酮類成分[4]。

黃酮類化合物傳統(tǒng)提取方法有有機溶劑提取、熱水提取、堿性水或堿性稀醇提取、系統(tǒng)溶劑提取法等[5]，新型提取技術(shù)有超聲波提取法、微波提取法、酶解法、超臨界流體萃取法、半仿生提取法等[5]。目前，關(guān)于水紅花子總黃酮提取工藝研究的報道較少，本文進(jìn)行了水紅花子總黃酮的超聲波提取及抗氧化性研究，旨在為水紅花子功能成分的應(yīng)用和生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水紅花子，采自長春市郊，除雜，于40℃干燥箱中干燥至恒重，粉碎后過40目篩。

95%(v/v)乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水（均為分析純，北京化工廠）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 儀器與設(shè)備

LK-400A型粉碎機（上海超億制藥機械設(shè)備有限公司）；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；FA2204B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；UV2000紫外可見分光光度計（尤尼柯(上海)儀器有限公司）；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-06-100B型電熱恒溫箱（武漢海聲達(dá)儀器設(shè)備有限公司）；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 樣品總黃酮提取液的制備和總黃酮含量的測定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品，參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和樣品提取液中總黃酮含量測定，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0111x+0.0567，R2=0.9998。

精密稱取水紅花子粉末5.00g，加入乙醇溶液室溫下浸泡一定時間后，在一定條件下超生波輔助提取一定時間，過濾，定容至250mL，精密吸取0.5mL樣品提取液，測定吸光度，計算樣品提取液中總黃酮的含量。

1.3.2 羥自由基(·OH)清除率測定[7-9]

向150mL的錐形瓶中依次加入濃度為6mmol·L-1的FeSO4溶液和H2O2溶液各30mL，混勻，加入6mmol·L-1水楊酸溶液45mL，37℃水浴下反應(yīng)15min，然后在波長510nm處測定其吸光度A0；取5支比色管，依次向其中加入以上的測定體系7mL，之后分別向5支比色管中加入水紅花子總黃酮提取液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加蒸餾水定容到10mL，搖勻，在37℃水浴中反應(yīng)15min，再于波長510nm處分別測定其吸光度Ax，以下式計算羥自由基清除率。

1.3.3 試驗設(shè)計

1.3.3.1 單因素試驗

基礎(chǔ)條件：5.00g水紅花子粉末、乙醇濃度55%(v/v)、料液比1:12(g·mL-1)、提取溫度40℃、功率100W、提取時間30min、提取次數(shù)1次、浸泡2h。

各因素水平：乙醇濃度35、45、55、65、75、85、95%(v/v)；提取溫度20、30、40、50、60、70、80℃；超生波功率40、50、60、70、80、90、100W；提取時間5、10、20、30、40、50、60min；料液比1:6、1:9、1:12、1:15、1:18、1:21、1:24、1:27(g·mL-1)；提取次數(shù)1次、2次、3次、4次；浸泡時間0、2、4、6、8、12、16、20、24h。

1.3.3.2 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對水紅花子總黃酮提取效果影響較大的4個因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗優(yōu)化水紅花子總黃酮的提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對水紅花子總黃酮提取量的影響

圖1 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

由圖1可知，水紅花子總黃酮提取量隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)55%時提取量最大。因此選擇乙醇濃度45%～65%(v/v)作為優(yōu)化范圍。

2.1.2 提取溫度對水紅花子總黃酮提取量的影響

圖2 提取溫度對總黃酮提取量的影響

由圖2可知，水紅花子總黃酮的提取量隨著溫度的提高而增加，因此提高溫度有利于總黃酮的提取。但是溫度過高，一方面使其中的活性成分易受到破壞，雜質(zhì)的溶出量增加，給后續(xù)操作帶來不便，成本費用增大；另一方面造成溶劑損失[10]。本文使用的超聲波清洗器最大操作溫度為80℃，綜合考慮，選擇60～80℃作為提取溫度的優(yōu)化范圍。

2.1.3 超聲波功率對水紅花子總黃酮提取量的影響

圖3 超聲波功率對總黃酮提取量的影響

圖4 提取時間對總黃酮提取量的影響

由圖3可知，總黃酮的提取量隨超聲波功率的增加而增加，因此超生波清洗器功率調(diào)整到最大功率100W為宜。

2.1.4 提取時間對水紅花子總黃酮提取量的影響

從圖4可知，提取時間30min之后水紅花子總黃酮提取量增加緩慢，選擇30～50min為提取時間的優(yōu)化范圍。

2.1.5 料液比對水紅花子總黃酮提取量的影響

由圖5可知，水紅花子總黃酮提取量隨著料液比的減小而增大，料液比降到1:18(g·mL-1)以下后，隨提取劑用量的增加總黃酮提取量增加不大，因此選擇1:15～1:21(g·mL-1)為料液比優(yōu)化范圍。

2.1.6 提取次數(shù)對水紅花子總黃酮提取量的影響

圖5 料液比對總黃酮提取量的影響

圖6 提取次數(shù)對總黃酮提取量的影響

由圖6可知，提取4次的提取量為2.01%，認(rèn)為提取4次總黃酮提取完全。提取2次后，總黃酮提取量增加不大，提取2次的提取量為1.87%，占提取4次的總提取量的93%，再增加提取次數(shù)會浪費溶劑、浪費時間，因此確定提取次數(shù)為2次較為適宜。

2.1.7 浸泡時間對水紅花子總黃酮提取量的影響

圖7 浸泡時間對總黃酮提取量的影響

由圖7可知，對原料先浸泡一定時間再超聲波輔助提取，有利于黃酮類化合物的溶出，水紅花子粉末浸泡16h時總黃酮提取量最大，繼續(xù)延長浸泡時間雜質(zhì)溶出量增加，干擾測定，曲線呈現(xiàn)下降趨勢，因此浸泡時間選擇在16h較適宜。

2.2 水紅花子總黃酮提取工藝條件的優(yōu)化

在超生波功率100W、浸泡2h、提取1次的條件下，進(jìn)行L9(34)正交試驗，正交試驗因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果

由R可知，4因素對水紅花子總黃酮提取效果的影響程度是A＞D＞C＞B。比較k值大小得出最佳提取工藝條件為A3B2C3D2，此條件下提取1次的提取量為2.89%，大于表2中A3B1C3D2條件下的2.68%，因此確定水紅花子總黃酮的最佳提取工藝條件為浸泡16h、超聲功率100W、乙醇濃度55%(v/v)、提取溫度70℃、料液比1:18(g·mL-1)、超聲波輔助提取時間40min、提取2次，最佳條件下總黃酮的提取量為6.14g/100g。

2.3 羥自由基(·OH)清除率的測定

取5g水紅花子粉末，在最佳提取工藝條件下提取總黃酮，提取液定容至250mL，稀釋2倍，按照1.3.2節(jié)方法測定水紅花子總黃酮對羥自由基(·OH)的清除率。由圖8可知，水紅花子總黃酮具有清除羥自由基(·OH)的能力。

圖8 總黃酮對·OH的清除作用

3 結(jié)論

超聲輔助提取技術(shù)(UAE)是利用超聲波的強振動、高加速度、強空化效應(yīng)、強攪拌作用來縮短天然產(chǎn)物有效成分進(jìn)入溶劑的時間，加快提取過程，提高提出率，并有效避免高溫對有效成分的破壞[11]。本文采用超生波輔助法提取水紅花子總黃酮，利用正交試驗確定最佳工藝條件為浸泡16h、超聲波功率100W、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、提取溫度70℃、料液比1:18(g·mL-1)、超聲波輔助提取時間40min、提取2次。羥自由基是已知最強的氧化劑，對細(xì)胞和組織的破壞作用最大[7]，本文的抗氧化實驗表明，水紅花子總黃酮提取物對羥自由基(·OH)具有清除作用。

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