孫桂亮 張承巍 李若文 徐海艷 崔大勇 魯質(zhì)成

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130041)

谷氨酸(Glu)是中樞興奮性遞質(zhì)，可以營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、促使神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育及軸突生長(zhǎng)，但是過(guò)量可以引起細(xì)胞死亡。有研究表明(As2O3)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻斷細(xì)胞周期、降低線粒體的膜內(nèi)外電位差以及增加P53蛋白的表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤的作用〔1～3〕。本研究針對(duì)Glu在As2O3抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中是否發(fā)揮作用展開(kāi)研究，為As2O3抗腦內(nèi)膠質(zhì)瘤的作用增加實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞從－80℃冰箱中取出，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、傳代。觀察細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)滿(mǎn)后，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色排斥試驗(yàn)活性測(cè)定，然后用PBS緩沖液制成細(xì)胞懸液。

1.2 Glu測(cè)定 將SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞配制成濃度為1×105個(gè)/ml，接種于6孔板中，加入新培養(yǎng)液后，放入孵箱中，5%CO2、37℃條件下孵育24 h，分別在各個(gè)孔中加入濃度分別為 0、1、2、4、8 μmol/L 的 As2O3，然后分別在加藥后的 24、48、72 h使用CMA600微透析分析儀，根據(jù)微透析操作說(shuō)明微量分析各組細(xì)胞液中Glu的濃度。

1.3 流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定氧自由基(ROS)的變化 將接種于24孔板(1 ×105/孔)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，分別加入 0、1、2、4、8 μmol/L As2O3，在孵箱孵育24、48、72 h 后每孔加入 50 μmol/L 熒光試劑1 ml，孵箱孵育30 min。吸出含熒光試劑的培養(yǎng)基，胰酶消化、離心、清洗細(xì)胞。使用FACS Calibur型美國(guó)B-D公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀，激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm，檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件，采用 One-Way ANO-VA方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度As2O3作用于SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞后Glu濃度的變化 與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比，隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)及作用濃度的增加，Glu濃度也逐漸增加(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度As2O3作用于SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞后Glu濃度變化( s，μmol/L)

表1 不同濃度As2O3作用于SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞后Glu濃度變化( s，μmol/L)

與0 μmol/L 組比較:1)P ＜0.05;下表同

As2O3(μmol/L)24 h 48 h 72 h 0 39.87±1.13 39.54±1.4 40.51±0.98 1 50.9±0.981) 73.68±1.451) 103.51±1.171)2 81.48±1.231) 118.47±1.451) 160.48±0.851)4 128.57±1.231) 167.88±1.391) 227.02±1.091)8 170.48±1.411) 220.4±1.261) 294.68±1.341)

2.2 不同濃度As2O3作用于SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞后ROS的變化 As2O3作用24、48 h后1 μmol/L組與未使用As2O3組無(wú)明顯差異(P＞0.05)，As2O3作用72 h后1 μmol/L組細(xì)胞內(nèi) ROS高于未使用 As2O3組(P ＜0.05);而 2、4、8 μmol/L 組，細(xì)胞染色比例隨As2O3作用時(shí)間的延長(zhǎng)及作用濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)ROS增加(P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 As2O3作用于SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞DCF染色比的變化( s，%)

表2 As2O3作用于SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞DCF染色比的變化( s，%)

As2O3(μmol/L)24 h 48 h 72 h 0 0.52±01.3 0.54±0.3 0.51±0.28 1 0.59±0.28 0.62±0.4 1.31±0.371)2 1.48±0.231) 2.91±0.381) 4.48±0.451)4 3.57±0.31) 4.82±0.411) 7.02±1.011)8 7.48±1.011) 9.45±1.061) 12.28±1.281)

3 討論

Glu多數(shù)存在于細(xì)胞內(nèi)，濃度可達(dá)細(xì)胞外的數(shù)千倍。腦脊液中的Glu通過(guò)α-酮戊二酸途徑及谷氨酰胺途徑生成。Glu的釋放依賴(lài)于細(xì)胞膜的胱氨酸-谷氨酸交換體——Xc系統(tǒng)，該轉(zhuǎn)運(yùn)體將一分子Glu轉(zhuǎn)運(yùn)到到細(xì)胞外的同時(shí)，也轉(zhuǎn)運(yùn)一分子的胱氨酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，二者相互偶聯(lián)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的胱氨酸，在還原酶的作用下生成半胱氨酸，半胱氨酸可以:①參與谷胱甘肽(GSH)的合成，GSH為重要的自由基清除劑;②擴(kuò)散出細(xì)胞后再次生成胱氨酸，參與下一次的谷氨酸-胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)細(xì)胞外的Glu升高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外Glu的濃度倒置，導(dǎo)致Glu轉(zhuǎn)運(yùn)方向轉(zhuǎn)為逆向，胱氨酸進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)被阻滯，引起細(xì)胞內(nèi)GSH的合成減少〔4〕，使重要的自由基清除劑——GSH的抗氧化應(yīng)激損傷能力下降，造成細(xì)胞內(nèi)的ROS大量蓄積，氧自由基攻擊位于細(xì)胞內(nèi)的一些超微結(jié)構(gòu)，特別是線粒體，出現(xiàn)一系列的生理生化反應(yīng)，引起細(xì)胞的損傷甚至死亡。

對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞來(lái)講，細(xì)胞外Glu的濃度升高是瘤體細(xì)胞生長(zhǎng)以及遷移所必需的內(nèi)環(huán)境〔5～7〕，而在使用As2O3后，細(xì)胞外Glu的濃度進(jìn)一步升高可能是因?yàn)锳s2O3與線粒體膜上腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合，作用于蛋白分子中的巰基，使其空間位置上相鄰的兩個(gè)巰基最后形成了二硫鍵，導(dǎo)致線粒體膜PTP的開(kāi)放，進(jìn)而引起線粒體膜電位下降〔8〕，引起SHG-膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的ROS數(shù)量明顯增多，該細(xì)胞通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)GSH的含量來(lái)抗細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷，導(dǎo)致Xc系統(tǒng)過(guò)度轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞外Glu濃度升高，而過(guò)度增多的谷氨酸，導(dǎo)致谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞內(nèi)胱氨酸減少，GSH合成的原材料的減少以及細(xì)胞內(nèi)增多的ROS引起細(xì)胞內(nèi)GSH逐漸耗竭，細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力下降，細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙甚至死亡。

由此可見(jiàn)，As2O3在體外抑制腦內(nèi)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖來(lái)源于Glu增多，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)GSH耗竭而引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的加強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

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