韓 俊，王 彬，馬 珂，閆昱博，董開源，劉芳娥

1)第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系 西安710032 2)第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系 西安710032 3)第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 西安 710032

睡眠不足在當(dāng)今處于重大工作壓力下的人群中很常見。睡眠不足可引起機(jī)體代謝紊亂，由此出現(xiàn)一系列健康問(wèn)題。因此，研究睡眠剝奪對(duì)機(jī)體的不良影響及其防治措施很有意義。實(shí)驗(yàn)[1-2]表明，睡眠剝奪作為一種強(qiáng)烈應(yīng)激源，對(duì)機(jī)體造成多方面負(fù)面影響，令動(dòng)物或人產(chǎn)生疲勞、學(xué)習(xí)記憶受損和行為改變，還可以對(duì)機(jī)體的血液循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)臟器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生很大危害。還有研究[3]表明，應(yīng)激可引起胃黏膜損傷從而引起消化系統(tǒng)的功能障礙。具有抗氧化特性的褪黑素可以在應(yīng)激導(dǎo)致的機(jī)體損傷中起保護(hù)作用[4]。但是，褪黑素對(duì)應(yīng)激引起的胃黏膜損傷的保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚，其相關(guān)報(bào)道較少。作者研究了褪黑素對(duì)睡眠剝奪大鼠胃黏膜損傷的影響及可能的作用機(jī)制，為睡眠剝奪引起的胃黏膜損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑及儀器成年、雄性、健康SD大鼠24只，體質(zhì)量(180±15) g(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。褪黑素(Sigma公司，使用前需少量乙醇助溶，以生理鹽水配制成所需濃度，終溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)<5%)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，GSH)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。睡眠剝奪裝置、離心機(jī)、721分光光度計(jì)、恒溫水浴箱等。

1.2實(shí)驗(yàn)分組將24只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組8只。分別為在大平臺(tái)上不剝奪睡眠并注射生理鹽水的對(duì)照組，睡眠剝奪并注射生理鹽水的模型組，睡眠剝奪并注射褪黑素的實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組和模型組于每日19: 00腹腔注射2 mL生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射15 mg/kg褪黑素2 mL，連續(xù)7 d。然后進(jìn)行睡眠剝奪3 d，期間依然按分組每日給藥。

1.3睡眠剝奪模型的建立采用小平臺(tái)水環(huán)境法[5]建立大鼠睡眠剝奪模型。制作30 cm×30 cm×30 cm的鼠箱，其中有4個(gè)高8.0 cm、直徑6.3 cm的圓形平臺(tái)，在平臺(tái)周邊注滿水，水面低于平臺(tái)面約1.0 cm。水溫保持在20 ℃左右。大鼠在平臺(tái)上可自行進(jìn)食、飲水但不可睡眠。若其睡眠，則肌肉

張力松弛而落入水中，只能恢復(fù)清醒再爬上平臺(tái)，如此反復(fù)則為睡眠剝奪。睡眠剝奪前，在給予大鼠褪黑素或生理鹽水腹腔注射時(shí)，將各組大鼠放在沒有注水的睡眠剝奪箱內(nèi)，讓其熟悉睡眠剝奪環(huán)境7 d。然后對(duì)模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行睡眠剝奪72 h，對(duì)照組大鼠也置于相同的睡眠剝奪箱中，但是大鼠站立的平臺(tái)直徑為16 cm，大鼠在平臺(tái)上可以自由睡眠。大鼠活動(dòng)空間內(nèi)持續(xù)40 W日光燈照射，室內(nèi)溫度控制在18～22 ℃。

1.4標(biāo)本采集取上述各組睡眠剝奪結(jié)束后的大鼠立即進(jìn)行眼球后靜脈叢取血并分離血清，然后沿劍突下正中剪開腹壁，暴露鼠胃，切下全胃，沿大彎側(cè)剪開胃壁，用生理鹽水沖洗干凈待檢。

1.5血清GSH、PGE2、MDA含量及胃黏膜損傷指數(shù)的測(cè)定取血清后，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，測(cè)量血清中GSH、PGE2及MDA含量。胃黏膜損傷指數(shù)的評(píng)定：胃黏膜損傷長(zhǎng)度<1 mm為1分，1～ mm為2分，2～ mm為3分， 3～ mm為4分，4～ mm則分段測(cè)量并評(píng)分；病灶寬度>2 mm評(píng)分乘以2；最終計(jì)算全胃病灶總的評(píng)分即為胃黏膜損傷指數(shù)。

1.6胃黏膜組織病理觀察胃黏膜損傷指數(shù)測(cè)定完畢后，在損傷明顯處取組織，石蠟包埋，切片，HE染色，并在光鏡下觀察。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，3組間血清MDA、GSH、PGE2含量及胃黏膜損傷指數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠血清GSH、MDA及PGE2的含量模型組相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，MDA含量升高，GSH含量降低，PGE2含量升高。實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于模型組來(lái)說(shuō)，MDA含量降低，GSH含量升高，PGE2含量降低。見表1。

2.2各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)結(jié)果顯示模型組胃黏膜損傷指數(shù)高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組低于模型組。見表1。

2.3各組大鼠胃黏膜組織病理觀察對(duì)照組大鼠胃黏膜光整完好，淡紅色，質(zhì)地柔軟，肉眼少見糜爛及潰瘍；模型組大鼠胃黏膜均有不同程度的充血、水腫，可見散在點(diǎn)狀出血、糜爛；實(shí)驗(yàn)組大鼠胃黏膜有輕度的糜爛和水腫。對(duì)照組大鼠鏡下黏膜層結(jié)構(gòu)完整，黏膜上皮層細(xì)胞完整，固有層腺體結(jié)構(gòu)完整，主細(xì)胞、壁細(xì)胞清晰可見，未見炎癥細(xì)胞；模型組大鼠鏡下黏膜層破壞，可見黏膜中斷現(xiàn)象，有局灶性壞死；實(shí)驗(yàn)組鏡下黏膜層細(xì)胞脫落，有少量黏膜糜爛和壞死現(xiàn)象。見圖1。

表1 3組大鼠血清MDA、GSH、PGE2含量及胃黏膜損傷指數(shù)比較

*:與對(duì)照組相比,P<0.05；#:與模型組相比,P<0.05。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理觀察結(jié)果(HE，×400)

3 討論

睡眠是人和哺乳動(dòng)物的基本生理需要，因此睡眠剝奪可引起機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡。睡眠剝奪大鼠的病理變化以營(yíng)養(yǎng)不良較為突出，主要繼發(fā)于能量消耗增多，體內(nèi)的氧自由基含量明顯增高，當(dāng)機(jī)體的抗氧化能力不足以清除增多的活性氧就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激[6]。胃黏膜損傷指數(shù)是衡量睡眠剝奪對(duì)大鼠胃黏膜損傷的重要指標(biāo)。損傷程度同時(shí)也可通過(guò)潰瘍個(gè)數(shù)及潰瘍大小來(lái)表示。該研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯低于模型組；模型組鏡下黏膜層多見病灶壞死區(qū)域，且出現(xiàn)黏膜層斷裂現(xiàn)象,而實(shí)驗(yàn)組鏡下黏膜層少見潰瘍及病灶壞死區(qū)域,說(shuō)明褪黑素對(duì)睡眠剝奪產(chǎn)生的應(yīng)激作用有明顯效果。對(duì)照組也出現(xiàn)潰瘍，可能由于每天腹腔注射對(duì)其造成了刺激從而導(dǎo)致大鼠應(yīng)激產(chǎn)生潰瘍。

褪黑素是由松果體、胃腸道、視網(wǎng)膜等多器官分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，是體內(nèi)抗自由基、抗氧化作用很強(qiáng)的活性物質(zhì)[7]；具有廣泛的生物學(xué)作用，除能直接清除和抑制氧自由基產(chǎn)生外，還能增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶的作用[8]。近年來(lái)其在消化系統(tǒng)疾病中的作用得到重視。

有研究[9]表明，氧自由基的大量產(chǎn)生在多種原因引起的胃黏膜損傷的病理過(guò)程中均起重要作用。而MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一，其產(chǎn)生的量與氧自由基的量及脂質(zhì)過(guò)氧化的程度呈正相關(guān)[10]，與自由基的清除能力呈負(fù)相關(guān)，是反映自由基對(duì)生物大分子的損傷程度及生物體抗氧化能力的最好指標(biāo)之一[11-12]，MDA增多與應(yīng)激作用有關(guān)。該研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清MDA含量明顯低于模型組,提示褪黑素對(duì)睡眠剝奪大鼠血清中MDA含量的升高有顯著的抑制作用，對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用可能與抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用有關(guān)，在睡眠剝奪對(duì)機(jī)體造成氧化損傷時(shí)起保護(hù)作用。

機(jī)體可通過(guò)酶類和非酶類2種分子來(lái)保護(hù)氧化應(yīng)激的細(xì)胞，后者的代表為GSH。GSH是在肝內(nèi)由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽物質(zhì)，廣泛分布于機(jī)體各器官內(nèi)，是細(xì)胞內(nèi)重要的水溶性抗氧化劑，它含有巰基，通過(guò)巰基與體內(nèi)的自由基結(jié)合，對(duì)過(guò)氧化物、自由基和親電子基起拮抗作用，能清除過(guò)氧化代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞生物功能[13]。GSH清除過(guò)氧化物時(shí)需在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶作用下轉(zhuǎn)化成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSSG經(jīng)谷胱甘肽還原酶催化還原為GSH繼續(xù)發(fā)揮抗氧化功能。實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中GSH的含量明顯低于對(duì)照組但高于模型組，提示褪黑素可促進(jìn)血清中GSH含量的增高，對(duì)睡眠剝奪造成機(jī)體氧化損傷起到防護(hù)作用。

PGE2由胃黏膜產(chǎn)生并釋放入血，被認(rèn)為是胃黏膜的保護(hù)因子，可增加黏膜血流，為黏膜細(xì)胞供應(yīng)充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，還可抑制胃酸、胃蛋白酶原分泌，刺激黏液和碳酸氫鹽分泌來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)酸堿度并維護(hù)胃黏膜的完整性，增強(qiáng)胃黏膜的防御功能[8]。在胃黏膜遭受應(yīng)激損害時(shí)，機(jī)體可以通過(guò)產(chǎn)生PGE2而起到對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用。該研究結(jié)果中模型組大鼠血清PGE2含量明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明睡眠剝奪引起的胃潰瘍促使機(jī)體產(chǎn)生PGE2來(lái)應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，以減少應(yīng)激帶來(lái)的不良影響。而實(shí)驗(yàn)組PGE2含量明顯低于模型組，推測(cè)可能的原因是作者在對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行睡眠剝奪之前就已經(jīng)用褪黑素進(jìn)行預(yù)處理，在睡眠剝奪期間，褪黑素對(duì)睡眠剝奪大鼠的胃黏膜損傷即起到了緩解或保護(hù)作用，從而使機(jī)體本身應(yīng)對(duì)應(yīng)激時(shí)的反應(yīng)沒有那么激烈，因此產(chǎn)生的PGE2也沒有模型組多，并猜測(cè)PGE2和褪黑素可能分別通過(guò)各自的途徑對(duì)氧化應(yīng)激引起的胃黏膜損傷起保護(hù)作用。該結(jié)果與Nassar等[14]的研究結(jié)果一致，而與王鑫國(guó)等[15]的研究結(jié)果并不完全一致，其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

睡眠障礙因素的不斷作用會(huì)導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生，將對(duì)機(jī)體產(chǎn)生巨大危害?，F(xiàn)在相當(dāng)多的人在研究如何減少睡眠剝奪所帶來(lái)的影響，從大腦、肝臟、免疫系統(tǒng)等方面分別闡述了睡眠剝奪的影響及可能的機(jī)制。作者著重強(qiáng)調(diào)對(duì)胃的研究，探討睡眠剝奪對(duì)消化系統(tǒng)的作用，為因睡眠剝奪產(chǎn)生的消化系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。褪黑素作為一種內(nèi)源性多效應(yīng)的生理活性物質(zhì)，具有低毒安全的特點(diǎn)[16]。迄今為止，其不良反應(yīng)僅為嗜睡，未見其他有關(guān)的毒理報(bào)道，在多種動(dòng)物體內(nèi)也未建立其半數(shù)致死劑量， 故其臨床應(yīng)用具有較高的安全性和前景。

[1]Papakonstantinou E,Ryan DH,Harris RB.Dietary fish oil does not protect rats exposed to restraint or sleep deprivation stress[J].Physiol Behav，2003,78(4/5):759

[2]Edéll-Gustafsson UM, Gustavsson G, Yngman Uhlin P.Effects of sleep loss in men and women with insufficient sleep suffering from chronic disease：a model for supportive nursing care[J]. Int J Nurs Pract，2003,9(1):49

[3]Matsumoto T,Yoshiyama S,Kobayashi T,et al.Mechanisms underlying enhanced contractile response to endothelin-1 in diabetic rat basilar artery[J].Peptides，2004,25(11):1985

[4]佘曉俊,韋京豫,李慧琴,等. 睡眠剝奪大鼠松果體中褪黑素含量測(cè)定[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002,20(5):343

[5]劉長(zhǎng)云,王海明,陳堅(jiān),等.大鼠睡眠剝奪后行為及下丘腦誘生型一氧化氮合酶mRNA表達(dá)的變化[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002,23(3):281

[6]唐慶娟,陶凱忠,胡淼淼,等. 72小時(shí)睡眠剝奪大鼠的氧化應(yīng)激[J].中華行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2003,12(5)：500

[7]黃碧蘭，王秋桂，余良主,等.褪黑素對(duì)大鼠應(yīng)激性胃粘膜損傷的保護(hù)作用及其機(jī)理[J].咸寧學(xué)院學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2006,20(4):288

[8]單巖，張謙，劉章鎖.褪黑素在大鼠慢性腎功能衰竭進(jìn)展中對(duì)腎組織細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2009,44(3):629

[9]Kwiecien S,Brzozowski T,Konturek SJ．Effects of reactive oxygen species action on gastric mucosa in various models of mucosal injury[J].J Physiol Pharmacol，2002,53(1)：39

[10]曲宏，劉華.褪黑素對(duì)高糖誘導(dǎo)白內(nèi)障形成抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].國(guó)際眼科雜志,2011,11(3):403

[11]Gutteridge JM. Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue damage[J].Clin Chem，1995, 41(12 Pt 2):1819

[12]Col C, Dinler K, Hasdemir O, et al. Oxidative stress and lipid peroxidation products: effect of pinealectomy or exogenous melatonin injections on biomarkers of tissue damage during acute pancreatitis[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2010,9(1):78

[13]張麗琴，陳興無(wú)，涂雄文，等.不同人群對(duì)香煙煙霧提取物炎癥反應(yīng)及其斯伐他汀調(diào)節(jié)效應(yīng)研究[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志,2010,30(8):711

[14]Nassar NN, Schaalan MF, Zaki HF, et al. Octreotide ameliorates gastric lesions in chronically mild stressed rats[J].World J Gastroenterol，2011，17(9):1135

[15]王鑫國(guó),馬志紅,牛麗穎,等.胃舒膠囊防治消化性潰瘍的機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床，2007,23(1):58

[16]胡愛民，張治國(guó)，侯志貞，等.褪黑素對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2011,36(2)：164