馬 輝，邊傳周，趙緒永，鄭寶亮，鄭 鳴

（鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校 生物工程系，河南 鄭州450011）

鵝副黏病毒病是由鵝副黏病毒（GPMV）引起的急性病毒性傳染病，病鵝及其分泌物、排泄物是本病的主要傳染源，主要以消化道病變?yōu)樘卣?。成年鵝群流行過(guò)程中發(fā)病率高達(dá)50%～70%，死亡率達(dá)10%～20%左右；在15日齡以下的鵝群中可引起100%的死亡，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。

1997年，我國(guó)王永坤等首次用SPF雞胚從患病鵝群中分離出鵝副黏病毒，此后陸續(xù)分離到多株病毒［2］。鵝副黏病毒（GPMV）屬于副黏病毒科，副黏病毒亞科，腮腺炎病毒屬，該病毒與新城疫病毒有部分相同的免疫原型［3］。鵝副黏病毒顆粒大小不一，形態(tài)不整，表面有密集纖突結(jié)構(gòu)，病毒內(nèi)部有囊膜包裹著的螺旋對(duì)稱的核衣殼?；蚪M為單股負(fù)鏈線型RNA，約15kb，包括6組基因，主要編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，其中M蛋白、HN蛋白和F蛋白為外膜蛋白，存在于病毒衣殼外，L蛋白、NP蛋白和P蛋白為內(nèi)部蛋白，存在于衣殼內(nèi)；另外，在GPMV基因轉(zhuǎn)錄中P基因還可產(chǎn)生V和W兩種非結(jié)構(gòu)蛋白［4］。

L基因編碼的L蛋白是GMPV所有結(jié)構(gòu)蛋白中分子量最大的一個(gè)，含2 204個(gè)氨基酸。L蛋白與P蛋白一起構(gòu)成有活性的病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)合物［5－6］。本試驗(yàn)通過(guò)RT－PCR方法擴(kuò)增了國(guó)內(nèi)分離株SF02的L基因的部分片段，經(jīng)序列測(cè)定驗(yàn)證，構(gòu)建了GPMV L基因片段的原核表達(dá)載體，并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)蛋白抗原性的檢測(cè)，獲得了重組的L基因主要抗原表位區(qū)，為進(jìn)一步研究L蛋白的功能及鵝副黏病毒病的預(yù)防和控制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和受體菌 鵝副黏病毒SF02株由鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校中心實(shí)驗(yàn)室保存；pGEM－T，購(gòu)自 TaKaRa公司；pGEX－6P－1、大腸桿菌 DH5α、BL－21由鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 dNTP Mixture、限制內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、DNA Ligation Kit Ver.2.0、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、RNA酶抑制劑、DL－2 000DNA Marker和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)等，購(gòu)自TaKaRa公司；高保真酶KOD－Plus，購(gòu)自TOYOBO公司；TRIzol試劑盒，購(gòu)自Invitrogen公司；M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)自Promega公司；Glutathione Sepharose 4B親和層析樹(shù)脂，購(gòu)自Pharmacia Biotech公司；兔抗雞IgG辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，購(gòu)自Sigma公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，雞抗GPM V血清由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 擴(kuò)增GPMV2L基因片段的引物的設(shè)計(jì) 參照GPMV SF02［7］株全基因組序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物擴(kuò)增F基因，引物序列為：

上 游 引 物P1：5′－GAAGGATCCATGGCGGGCTCCGGTCCTGAA－3′（BamHⅠ），下游引物P2：5′－CCGCTCGAGGTTCAGGTTTCCGTAGACTAA－3′（XhoⅠ）。

1.4 鵝副黏病毒的增殖與RNA的提取 種毒經(jīng)1∶5 000稀釋后，接種于10日齡SPF雞胚絨毛尿囊腔（0.2mL/胚），同時(shí)以無(wú)菌生理鹽水相同條件接種作為對(duì)照，37℃培養(yǎng)，收集24～48h接種病毒的死亡雞胚尿囊液及對(duì)照組尿囊液，保存于－70℃?zhèn)溆?。用Trizol試劑提取病毒RNA，對(duì)照組尿囊液以相同條件及步驟進(jìn)行處理。

1.5 擴(kuò)增L基因片段 RT－PCR反應(yīng)參照 MMLV Reverse Transcriptase RNase H Minus的說(shuō)明進(jìn)行，加入設(shè)計(jì)的引物以合成第一鏈。以cDNA為模板，高保真酶KOD－Plus擴(kuò)增了L基因片段，PCR反應(yīng)體系為：PCR Buffer 5μL，dNTPs 5μL，Mg2＋2μL，P1、P2引物各1.5μL，cDNA 模板2 μL，KOD－Plus（1.0U/μL）1μL，加無(wú)菌水至總體積為50μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃ 變性5min，然后94℃1min，58℃1min，68℃1min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸10min。以瓊脂糖凝膠電泳30min，分析并記錄掃描結(jié)果。陰性對(duì)照用無(wú)菌水代替模板。

1.6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將回收的L基因片段與pGEX－6P－1載體經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后通過(guò)T4DNA連接酶連接，采用氯化鈣轉(zhuǎn)化法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入BL－21感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Amp的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。經(jīng)菌落PCR鑒定和質(zhì)粒的酶切鑒定，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.7 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá) 取重組菌接種至含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入IPTG以不同的終濃度50μmol/L、100μmol/L，不同的誘導(dǎo)時(shí)間2h、3h、4h，不同誘導(dǎo)溫度30℃、37℃進(jìn)行誘導(dǎo)，以 pGEX－6P－1－L不加IPTG 為對(duì)照。菌體經(jīng)超聲波破碎，制備蛋白質(zhì)電泳樣品，使用SDS－PAGE方法檢測(cè)融合蛋白表達(dá)情況。

1.8 GST－L融合蛋白的親和純化 將Glutathione Sepharose 4B樹(shù)脂填料與菌體超聲破碎后的上清混勻，室溫孵育，填料親和吸附融合蛋白后棄去上清；然后加1倍柱床體積的還原性谷胱甘肽洗脫，使融合蛋白從填料中釋放。SDS－PAGE檢測(cè)每次的洗脫產(chǎn)物，并利用Bradford法測(cè)定純化蛋白含量［8］。

1.9 Western blot檢測(cè)重組蛋白的抗原性 將GST－L融合蛋白進(jìn)行 Western－blot檢測(cè)，以鵝副黏病毒陽(yáng)性雞血清作為一抗，用兔抗雞IgG辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體作為二抗［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPMV L基因片段的克隆 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到561bp左右的片段，與預(yù)期目的大小相符（圖1）。

圖1 GPMV L基因片段擴(kuò)增

2.2 原核表達(dá)載體pGEX－6P－1－L的鑒定 用BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒雙酶切，出現(xiàn)預(yù)期大小的片段（圖2）。將酶切鑒定后的重組質(zhì)粒送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示，L基因片段與pGEX－6P－1載體連接正確，說(shuō)明pGEX－6P－1－L表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 pGEX－6P－1－L雙酶切

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測(cè) 將帶有重組表達(dá)質(zhì)粒的BL21重組菌培養(yǎng)后，IPTG終濃度50 μmol/L，37℃培養(yǎng)3h誘導(dǎo)條件下，SDS－PAGE顯示在大約47kD處有蛋白表達(dá)，與預(yù)期大小一致，且在沉淀和上清中都存在，檢測(cè)上清中融合蛋白含量為380mg/L。大量誘導(dǎo)表達(dá)GST－L融合蛋白，使用Glutathione Sepharose 4B樹(shù)脂填料親和純化，得到了較高純度的融合蛋白（圖3）。

圖3 pGEX－6P－L誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物和純化結(jié)果的SDS－PAGE分析

2.4 純化的重組蛋白的Western blot分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS－PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC）上，進(jìn)行 Western blot檢測(cè)，在47kD左右可見(jiàn)特異性條帶（圖4），說(shuō)明pGEX－6P－1－L重組蛋白可與鵝副黏病毒多克隆抗體反應(yīng)，表明重組蛋白具有較好的抗原性。

圖4 重組質(zhì)粒pGEX－6P－1－L表達(dá)產(chǎn)物的 Western blot檢測(cè)

3 討論

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的載體在原核、真核系統(tǒng)中可以有效進(jìn)行蛋白表達(dá)。原核表達(dá)具有操作方便、快捷、需時(shí)較短、表達(dá)量大、適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，pGEX表達(dá)系統(tǒng)中GST融合表達(dá)蛋白可以增加外源蛋白的可溶性，并且GST標(biāo)簽利于后續(xù)的純化，另外融合蛋白中的GST標(biāo)簽可以被蛋白酶很方便的切除下來(lái)。

目前，鵝副黏病毒具有高度發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鵝一旦發(fā)病，目前并無(wú)明顯治療效果的藥物。在預(yù)防鵝副黏病毒病時(shí)主要方法為疫苗免疫，目前使用的弱毒苗存在著毒性返祖的危險(xiǎn)，而鵝副黏病毒油乳劑滅活苗免疫時(shí)常需同時(shí)注射抗鵝副黏病毒血清，且存在免疫期短，免疫時(shí)常失敗等情況［10］。

L蛋白是鵝副黏病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的主要部分，其中L蛋白N端數(shù)個(gè)氨基酸參與病毒RNA的轉(zhuǎn)錄與修復(fù)，而且不同于HN和F蛋白，L蛋白這一區(qū)段具有高度保守性，具有良好的免疫原性，因此L蛋白可以用作鑒別副黏病毒的診斷抗原［11－12］；另外鵝副黏病毒病在形態(tài)學(xué)上與其他禽副黏病毒病難以區(qū)分，急需建立特異敏感的免疫學(xué)診斷方法，因此我們克隆表達(dá)了L基因的N端部分，通過(guò)SDS－PAGE電泳和Western－blot的結(jié)果表明，表達(dá)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為47kD，與理論值相符；并通過(guò)親和純化為制備大量及高純度的GPMV診斷抗原打下了良好的基礎(chǔ)。我們期望通過(guò)融合表達(dá)鵝副黏病毒抗原區(qū)為研制鵝副黏病毒亞單位疫苗和篩選L蛋白特異單抗奠定基礎(chǔ)。

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