張永斌，劉曉秋，陳 嘉，高 欣，伍軍軍，李守軍

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東 廣州510405；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510642）

糖尿病胃腸損傷是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的常見并發(fā)癥之一，在糖尿病者中可占到20%以上［1］，其胃腸并發(fā)癥常影響口服降糖藥物和其他藥物的療效，以及食物的代謝吸收，進(jìn)而影響糖尿病的進(jìn)程［2］。糖尿病胃腸損傷的發(fā)病機(jī)制可能跟糖尿病狀態(tài)下的氧化應(yīng)激及糖鏈缺陷有關(guān)。一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）存在結(jié)構(gòu)性NOS（cNOS）和誘導(dǎo)型 NOS（iNOS），催化產(chǎn)生一氧化氮（Nitric oxide，NO）和前列腺素（prostaglandins，PGs），在保全黏膜完整性方面起關(guān)鍵性作用，但另一方面NO和PGs產(chǎn)生過多，將導(dǎo)致胃腸黏膜損傷［3－4］。α－甘露糖苷酶（alpha－mannosidase，MAN1－A1）是一種參與糖鏈合成和代謝的重要蛋白酶，是一類關(guān)鍵性糖苷酶，在糖鏈的形成過程和糖蛋白在溶酶體的降解過程中發(fā)揮重要作用［5］，MAN1A1活性降低會(huì)影響機(jī)體合成復(fù)雜型糖鏈，導(dǎo)致N－糖鏈缺陷，因而致細(xì)胞增生、移行缺陷及細(xì)胞的死亡，因而影響組織損傷修復(fù)［6－8］。本研究旨在建立糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型，動(dòng)態(tài)觀察補(bǔ)中益氣丸對(duì)糖尿病大鼠NO、MAN1A1、PGs和AMS的影響，探討糖尿病狀態(tài)下胃黏膜損傷的發(fā)病機(jī)制及補(bǔ)中益氣丸的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠100只，體重180g～220g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 補(bǔ)中益氣丸顆粒：九芝堂股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：201108005；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）：美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)：110610；NO和淀粉酶（AMS）試劑盒：南京建成科技有限公司，批號(hào)：20120604，20120606；1，2－α－甘露糖苷酶（MAN1A1）、大鼠前列腺素 E2（PGE2）和大鼠6－酮前列腺素F1α（6－keto－PGF1α）ELISA 試劑盒：武漢華美生物工程試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：LotA28010249、LotC0302020148、LotB25011315。

1.3 糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型的造模方法 大鼠禁食不禁水12h后，腹腔注射STZ（用0.1mol/L，pH值4.2的檸檬酸鈉－檸檬酸緩沖溶液配制成10mg/ml的溶液），劑量55mg/kg，在STZ注射72 h后監(jiān)測(cè)隨機(jī)血糖，連續(xù)3次血糖值≥16.8mmol/L，且有多飲、多尿，多食癥狀，入選糖尿病動(dòng)物模型，糖尿病造模同時(shí)灌胃30%乙醇，劑量10mL/kg，連4周。

1.4 動(dòng)物分組及處理 大鼠隨機(jī)分為3組：正常組26只，糖尿病模型組35只，糖尿病＋補(bǔ)中益氣丸組39只（簡(jiǎn)稱中藥組，下同）。各組動(dòng)物從試驗(yàn)第5周起開始給藥，正常組及模型組等體積生理鹽水（20 mL/kg·d）灌胃，連12周，中藥組給予補(bǔ)中益氣湯灌胃，3.75g/kg·d，連12周。

1.5 標(biāo)本提取及處理 試驗(yàn)第8周、12周和16周末，動(dòng)物空腹過夜，第2天早晨每組處死動(dòng)物6只，腹主動(dòng)脈采血5mL，3 000r/min離心10min，取上清存于－20℃冰箱待測(cè)；采血后取胃，沿胃大彎剪開并翻轉(zhuǎn)胃腔，漂洗于4℃生理鹽水，除去胃腸腔內(nèi)容物，濾紙吸干，計(jì)算胃黏膜損傷指數(shù)并拍照；剪1/3胃，稱重，用冷PBS洗滌2次，低速勻漿，過200鉬鎳篩后，4℃低溫28 000r/min離心20min，取上清液－80℃低溫保存，待測(cè)。

1.6 測(cè)定指標(biāo)和方法：

1.6.1 胃黏膜損傷指數(shù)的測(cè)量 按Guth標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算胃黏膜損傷指數(shù)，無可見損傷為0分；點(diǎn)狀出血為1分；線狀出血、長(zhǎng)度＜1mm為2分；線狀出血、長(zhǎng)度1～2mm為3分；線狀出血、長(zhǎng)度2～4mm為4分；線狀出血、長(zhǎng)度＞4mm為5分；線狀出血、寬度＞1mm時(shí)分值×2。

1.6.2 胃黏膜組織病理學(xué)分析 取1/3胃組織作10%甲醛固定，行H.E.染色觀察。

1.6.3 NO含量、α－甘露糖苷酶活性檢測(cè) ELISA法測(cè)定血清α－甘露糖苷酶、硝酸還原酶法測(cè)定血清NO含量。

1.6.4 淀粉酶活性檢測(cè) 按試劑盒方法測(cè)定血清和胃黏膜勻漿液的AMS活性（紫外分光光度法）。AMS活性測(cè)定中定義：100mL血清或每毫升組織勻漿液在37℃與底物作用30min，水解10mg淀粉為一個(gè)單位。

1.6.5 前列腺素 E2、6－酮前列腺素 F1α含量測(cè)定ELISA法測(cè)定胃黏膜勻漿液前列腺素E2、6－酮前列腺素F1α含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±S表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 模型建立情況 注射STZ后，造模大鼠中有72%出現(xiàn)血糖持續(xù)升高并陸續(xù)發(fā)生死亡（空腹血糖≥16.8mmol/L），毛色枯黃無光澤、毛態(tài)豎立、精神倦怠、體型消瘦、飲水排尿增多、懶動(dòng)等癥狀，30%乙醇灌胃4周后剖取鼠胃，模型組和治療組均發(fā)現(xiàn)點(diǎn)狀、條索狀的胃黏膜糜爛、出血灶，試驗(yàn)16周時(shí)，模型組胃壁變薄、變輕，見有潰瘍（見后插－彩版圖1），H.E.染色結(jié)果顯示，模型組胃黏膜層上皮細(xì)胞黏液變薄、缺失、細(xì)胞間隙變大）、有輕度的壞死（見后插－彩版圖2）。從血糖水平、胃黏膜肉眼觀察和病理觀察結(jié)果顯示，初步建立了較穩(wěn)定的糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型。

2.2 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)的比較 模型組和治療組均發(fā)現(xiàn)點(diǎn)狀、條索狀的胃黏膜糜爛、出血灶，隨病程進(jìn)展，兩組胃壁逐漸變薄，變輕，見有潰瘍，治療組經(jīng)補(bǔ)中益氣丸治療后，較模型組顯著降低（見表1）。

表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)的比較 （n＝6）

2.3 各組大鼠血清NO和1，2－α－甘露糖苷酶含量動(dòng)態(tài)比較 模型組血清NO含量在試驗(yàn)第12周、16周時(shí)較正常組及中藥組顯著提高（P＜0.01或P＜0.05）；模型組血清 MAN1A1有降低的趨勢(shì)，在第12周、第16周較正常組顯著降低（P＜0.05），中藥組則逐漸提高，在第12周和第16周時(shí)與正常組已無顯著差異（P≥0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清NO、MAN1A1水平的動(dòng)態(tài)比較 （n＝6）

2.4 各組大鼠血清及胃黏膜淀粉酶活性比較 模型組和中藥組胰腺AMS活性較正常組極顯著降低（或P＜0.05），中藥組降低更甚于模型組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≥0.05）；模型組和中藥組血清淀粉酶活性較正常組極顯著降低（P＜0.01），但均呈現(xiàn)逐漸提高，在實(shí)驗(yàn)第16周時(shí)，中藥組AMS活性較模型組顯著提高（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清和胰腺組織的AMS活性動(dòng)態(tài)比較 （n＝6）

2.5 各組大鼠胃黏膜前列腺素E2和6－酮前列腺素F1α的動(dòng)態(tài)比較 模型組PGE2含量較正常組極顯著降低（P＜0.05），中藥組經(jīng)補(bǔ)中益氣丸治療后在第12周和第16周，時(shí)較模型組顯著提高（P＜0.05）并和正常組已無顯著差異（P≥0.05）；模型 組 6－keto－PGF1α含量較正常組極顯著提高（P＜0.01），中藥組逐步恢復(fù)，較模型組顯著降低（P＜0.05），與正常組無顯著差異（P≥0.05），見表4。

表4 各組大鼠胃黏膜PGs的動(dòng)態(tài)比較 （n＝6）

3 討論

本試驗(yàn)首次采用腹腔注射STZ結(jié)合30%乙醇灌胃方法制作糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型，糖尿病大鼠普遍出現(xiàn)胃黏膜充血和點(diǎn)狀出血，隨病程延長(zhǎng)，胃壁變薄。從胃黏膜損傷肉眼觀察結(jié)果和病理學(xué)檢查結(jié)果中顯示，本試驗(yàn)已成功制作出糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型。

No和PGs均由一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS ）和環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）催化產(chǎn)生，共同構(gòu)筑黏膜防御系統(tǒng)，在保全黏膜完整性方面起關(guān)鍵性作用，但另一方面NO和PGs產(chǎn)生過多或過少，將導(dǎo)致胃腸黏膜損傷。研究發(fā)現(xiàn)［9］，NO與糖尿病慢性并發(fā)癥密切相關(guān)，在糖尿病的早期表現(xiàn)為NO水平的升高，而在晚期則為NO水平的下降。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組血清NO濃度明顯高于正常對(duì)照組，在12周達(dá)到最高，16周時(shí)有所下降，可推測(cè)造模12周左右的大鼠處于糖尿病中期；糖尿病代謝紊亂使NO大量合成，同時(shí)模型組血清PGE2含量降低，而6－keto－PGF1α含量升高，NO和PGs的共同作用，使模型組的胃黏膜損傷指數(shù)上升。

N－糖基化是機(jī)體蛋白質(zhì)翻譯后的一種重要的修飾過程。MAN1A1是一種參與糖蛋白合成和代謝的重要蛋白酶，是一類關(guān)鍵性糖苷酶，由很多成員組成，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、溶酶體中，它在聚糖從高甘露糖型轉(zhuǎn)化成復(fù)雜型結(jié)構(gòu)中起重要的作用，α－甘露糖苷酶活性降低，會(huì)影響機(jī)體合成復(fù)雜型糖鏈，導(dǎo)致糖鏈缺陷，因此，測(cè)定MAN1A1活性，可反映出N－糖鏈的合成是否存在缺陷。淀粉酶主要由唾液腺和胰腺分泌，是胰腺外分泌主要的分泌顆粒酶原，研究發(fā)現(xiàn)，N－糖基化影響淀粉酶分泌，即C－結(jié)構(gòu)域N－糖基化的缺陷會(huì)抑制大鼠胰腺α－淀粉酶的分泌和活性［10］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組血清1，2，α－甘露糖苷酶活性、血清AMS和胰腺AMS均比正常組明顯下降，反映出N－糖鏈的合成存在缺陷。MAN1A1活性降低會(huì)影響機(jī)體合成復(fù)雜型糖鏈，導(dǎo)致N－糖鏈缺陷，因而致細(xì)胞增生、移行缺陷及細(xì)胞的死亡，因而影響組織損傷修復(fù)。

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”的范疇，補(bǔ)中益氣湯為益氣健脾經(jīng)方，其成分為黃芪、黨參、甘草、白術(shù)、當(dāng)歸、升麻、柴胡和陳皮。臨床上應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯加味治療胃潰瘍、糖尿病性胃輕癱、糖尿病性腹瀉等病證，均取得了較好的療效［11－15］。王氏等［16］研究認(rèn)為，本方益氣健脾的作用可能與其促進(jìn)胰酶的分泌作用有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組糖尿病大鼠均有胃黏膜充血和點(diǎn)狀出血，經(jīng)補(bǔ)中益氣湯治療后，治療組的胃黏膜損傷情況有所改善，可有效提高血清NO、AMS和MAN1A1活性，提高胃黏膜PGE2和降低6－keto－PGF1α的含量，但不能提高胰腺 AMS的活性，血清AMS含量升高主要來源于唾液腺，表明補(bǔ)中益氣湯可能主要影響唾液AMS活性，尚需進(jìn)一步求證。糖尿病狀態(tài)下胃黏膜損傷的發(fā)病機(jī)制可能跟糖尿病狀態(tài)下的NO、MAN1A1、PGs缺陷有關(guān)，表現(xiàn)在NO、PGs代謝紊亂，MAN1A1和淀粉酶活性降低，而補(bǔ)中益氣湯對(duì)以上異常有顯著治療作用，可能是通過促進(jìn)NO生成、升高 MAN1A1活性，因而促進(jìn)蛋白N－糖基化。

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