任雪萍 姜 藻 張全安

我們以人胃癌SGC-7901細胞為研究對象，觀察環(huán)巴胺對胃癌細胞生長和β-catenin、E-cadherin基因表達的影響，初步探查其抗腫瘤的機制，為胃癌治療尋找新靶點，為環(huán)巴胺臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株SGC-7901購自中國科學院上海細胞生物學研究所;環(huán)巴胺(Cyclopamnie)購自Biomol公司;RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、AO/EB染色試劑盒購自Sigma公司;細胞周期試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;β-actin及β-catenin、E-cadherin基因引物購自Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株SGC-7901細胞在5%CO2、37℃條件下，用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)及鏈霉素(100 μg/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制情況 用胰酶消化細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×104/ml，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔 200 μl，在 37℃、5%CO2的飽和濕度條件下孵育過夜。實驗分為實驗組、陰性對照組及空白對照組，實驗組加入終濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、120 μmol/L的環(huán)巴胺，每組設(shè)3個復(fù)孔。各組分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，每孔加入 DMSO 150 μl，振蕩器上振蕩10 min，混勻后應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處測吸光度(A)值，細胞存活率(%)=(藥物干預(yù)組A平均值/陰性對照組A平均值)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 AO/EB染色熒光顯微鏡觀察細胞凋亡 取對數(shù)生長期SGC-7901細胞，胰酶消化制成單細胞懸液，接種于六孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜后加入終濃度為20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 的環(huán)巴胺，另設(shè)陰性對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集各組細胞，調(diào)整細胞濃度為106/L;取100 μl細胞懸液，加入5 μl混合熒光染液:100 μg/ml丫碇橙(AO)和 100 μg/ml嗅乙啶(EB)混勻;取上述混合液一滴，滴在潔凈玻片上，加蓋玻片后立即置熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞形態(tài)。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡周期 取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，分別加入終濃度為 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 的環(huán)巴胺，作用24 h后，收獲各組細胞制成單細胞懸液，4℃PBS洗滌3次，細胞重懸于預(yù)冷的80%乙醇中，吹打均勻，4℃儲存過夜，離心細胞，PBS洗滌細胞3次。依次加入100 μl Rnase A 及 PI，4℃ 避光染色 30 min，應(yīng)用流式細胞儀測定細胞周期，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 RT-PCR 法檢測 β-catenin、E-cadherin mRNA表達 分別收集經(jīng) 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的環(huán)巴胺作用24 h的細胞及空白對照組細胞。按TRIzol試劑盒說明書提供的方法提取各組細胞總RNA，按RT-PCR試劑盒說明書提供的方法將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板進行PCR擴增。β-catenin:上游引物為 5＇-CCCACTAATGTCCAGCGTTT-3＇，下游引物為5 ＇-TCACGATGATGGGAAAGGTT-3 ＇，產(chǎn)物長度為323bp;E-cadeherin:上游引物為 5＇-GGCCAGGAAATCACATCCTA-3＇，下游引物為5 ＇-GTGCAGTGGCTCATGTCTGT-3＇，產(chǎn)物長度為407 bp;β-actin:上游引物為5-AGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTT-3＇，下游引物為 5 ＇-GAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGC-3 ＇，產(chǎn)物長度為600 bp。PCR擴增條件:94℃ 2 min，94℃30 s，59℃ 30 s，72℃ 40 s，30 個循環(huán)，72℃ 延伸7 min。RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK檢驗。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)巴胺對人胃癌SGC-7901細胞的生長抑制作用

表1 環(huán)巴胺對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用(±s，%)

表1 環(huán)巴胺對人胃癌SGC-7901細胞的抑制作用(±s，%)

注:與對照組比較，▲為P＜0.05;相同時間點組內(nèi)或相同劑量組內(nèi)兩兩比較，★為 P＜0.05。

環(huán)巴胺濃度(μmol/L)生長抑制率24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 5 5.66 ±0.67▲ 9.89 ±0.31▲ 14.76 ±0.84▲★10 11.75 ±0.99▲★ 16.79 ±0.54▲★ 22.03 ±0.78▲★20 19.19 ±0.37▲★ 25.68 ±1.23▲★ 31.01 ±0.36▲★40 35.07 ±1.69▲★ 46.06 ±0.79▲★ 54.55 ±1.37▲★80 58.49 ±1.34▲★ 68.73 ±2.46▲★ 79.76 ±0.82▲★120 69.36 ±1.60▲★ 80.14 ±1.36▲★ 89.19 ±1.20▲★

由表1可見，不同濃度的環(huán)巴胺作用于人胃癌SGC-7901細胞24、48、72 h后，細胞生長受到不同程度抑制。隨著環(huán)巴胺濃度的增加及作用時間的延長，其生長抑制作用增強，環(huán)巴胺的作用強度與劑量和作用時間成呈正相關(guān)，藥物組與對照組比較以及各藥物組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 AO/EB染色熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡

熒光顯微鏡下可見，正常陰性對照組細胞結(jié)構(gòu)正常，核染色質(zhì)著均勻綠色。環(huán)巴胺實驗組可見早期凋亡細胞，細胞縮小、變圓，邊緣毛糙，核染色質(zhì)著亮綠色呈固縮狀或圓珠狀，位于細胞的一側(cè);同時可見晚期凋亡細胞，核染色質(zhì)呈桔紅色，濃聚和偏向。隨著環(huán)巴胺濃度的增加，早期凋亡及晚期凋亡細胞增多。

2.3 環(huán)巴胺對人胃癌SGC-7901細胞周期的影響

人胃癌SGC-7901細胞經(jīng)不同濃度環(huán)巴胺作用24 h后，細胞周期中DNA合成前期(G0/G1期)的比例增高，DNA合成期(S期)的比例降低，G2/M期變化不明顯，G1周期前出現(xiàn)凋亡峰，細胞阻滯在G0/G1期，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，各藥物組間比較差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.4 環(huán)巴胺對SGC-7901細胞中E-cadherin、β-catenin基因表達的影響

RT-PCR結(jié)果表明在人胃癌細胞SGC-7901中存在E-cadherin、β-catenin mRNA異常表達。與陰性對照組相比，經(jīng)20μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 的環(huán)巴胺作用24 h后，E-cadherin mRNA的表達水平上調(diào)，β-catenin mRNA的表達水平下調(diào)。在圖像處理系統(tǒng)上分析得出各基因產(chǎn)物的光密度，以β-actin的光密度值為參照物，得到E-cadherin、β-catenin mRNA表達的半定量結(jié)果。此結(jié)果顯示隨著環(huán)巴胺濃度增加，E-cadherin mRNA表達水平增高越明顯，β-catenin mRNA表達水平下降越明顯，與對照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，見圖1。

表2 環(huán)巴胺作用于SGC-7901 24 h后細胞周期變化情況(±s，%)

表2 環(huán)巴胺作用于SGC-7901 24 h后細胞周期變化情況(±s，%)

注:*為不同濃度環(huán)巴胺作用后G0/G1期比較，P＜0.05;且兩兩比較有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。

環(huán)巴胺濃度(μmol/L)細胞周期G0/G1期 S期 G2/M期0 51.79 ±1.45*11.02 ±1.34 7.01 ±1.37 39.32 ±1.56 8.89 ±1.32 20 58.01 ±1.33* 33.93 ±1.24 8.06 ±0.54 40 67.69 ±2.01* 24.46 ±1.11 7.85 ±1.68 80 81.97 ±2.11*

圖1 不同濃度環(huán)巴胺作用SGC-7901細胞24 h后E-cadherin和β-catenin mRNA的表達變化

3 討論

本試驗以人胃癌細胞SGC-7901為研究對象，MTT比色法結(jié)果顯示環(huán)巴胺對SGC-7901細胞的增殖有顯著抑制作用，其作用強度與劑量和作用時間呈正相關(guān)。熒光顯微鏡下觀察到典型的凋亡細胞形態(tài)。流式細胞分析結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，環(huán)巴胺處理組G0/G1期細胞所占比例隨著濃度的增加逐漸上升，而S期細胞的比例則隨著濃度的增加逐漸下降。環(huán)巴胺將細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞DNA前期的合成，阻滯細胞進入周期復(fù)制，從而引起細胞凋亡。

胃癌浸潤和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，目前研究表明，Wnt信號通路參與胃癌形成，在大多數(shù)胃癌中被激活［1］。Wnt信號通路是自我更新信號通路之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Wnt信號通路的下游靶基因包括 CD44、MMP-7、cylinD1、c-Myc、Claudin-1等［2］。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是 Wnt信號通路的正向調(diào)節(jié)因素及重要的效應(yīng)分子。正常發(fā)育成熟細胞β-catenin處于低或無表達狀態(tài)，Wnt信號通道處于關(guān)閉狀態(tài);β-catenin的異常表達可引起Wnt信號通路的異常激活，從而引起其下游靶基因的異常激活，進而誘發(fā)細胞癌變［3］。韓競春等［4］應(yīng)用免疫組化、RT-PCR和Western蛋白印跡等方法在胃癌組織和細胞系中檢測Wnt信號途徑的狀態(tài)，結(jié)果顯示W(wǎng)nt-2、β-catenin和TCF4在胃癌組織中的表達明顯高于癌前病變組織，Wnt信號通路呈活化狀態(tài)。Cheng等［5］在大部分中國胃癌組織(包括腸型和彌漫型胃癌)中都檢測到β-catenin異常的核內(nèi)積聚，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及腫瘤分期呈正相關(guān)。Zhang等［6］結(jié)果顯示β-catenin表達在胃癌組織中的表達顯著高于正常組織，且其表達水平與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)。本研究胃癌細胞SGC-7901中β-catenin mRNA呈異常高表達，經(jīng) 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 環(huán)巴胺處理24 h后，β-catenin mRNA表達水平逐漸下降，本試驗結(jié)果表明在胃癌細胞SGC-7901中存在Wnt信號通路的激活，環(huán)巴胺可能通過下調(diào)β-catenin的表達而抑制Wnt信號通路，進一步下調(diào)各種靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)是細胞間黏附連接的主要分子，可與細胞內(nèi)的連環(huán)蛋白(主要為β-catenin)結(jié)合形成鈣黏附素－連環(huán)蛋白復(fù)合體，從而介導(dǎo)細胞間黏附，其陽性表達可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［7］。正常胃黏膜上皮E-cadherin呈強陽性表達。低表達或失活的E-cadherin導(dǎo)致細胞黏附功能降低或喪失，一方面使得腫瘤細胞易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移;另一方面可釋放βcatenin，胞內(nèi)游離的β-catenin增加，從而激活Wnt信號通路，使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化［8］。Sun等［9］應(yīng)用免疫組化法檢測58例胃癌組織、40例癌前病變胃組織和42例慢性非萎縮性胃炎組織，結(jié)果顯示胃癌組織中β-catenin的表達明顯高于癌前病變胃癌組織和慢性非萎縮性胃炎組織，E-cadherin表達水平明顯低于癌前病變胃組織和慢性非萎縮性胃炎組織。Yuan等［10］應(yīng)用免疫組化檢測165胃癌組織，結(jié)果表明在胃癌組織中E-cadherin蛋白表達水平顯著降低。Xing等［11］進行的一項薈萃分析，評估了26項研究包括4 383例胃癌患者E-cadherin的免疫組化表達和總生存期與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示E-cadherin表達下調(diào)與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、分化程度、血管侵犯和胃癌的組織學類型相關(guān)，是胃癌不良預(yù)后因素。本實驗研究結(jié)果顯示，在胃癌細胞SGC-7901中，E-cadherin mRNA 呈低表達，經(jīng) 20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L環(huán)巴胺處理24 h后，E-cadherin mRNA表達水平逐漸上升，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義。E-cadherin基因表達上調(diào)，一方面增強了細胞間的黏附作用，另一方面使胞內(nèi)游離的β-catenin降低，核內(nèi)轉(zhuǎn)移減少，從而可能進一步抑制Wnt信號通路，這可能是環(huán)巴胺誘導(dǎo)SGC-7901細胞凋亡的又一分子機制。

本試驗證實，在胃癌細胞 SGC-7901中存在βcatenin、E-cadherin的異常表達，環(huán)巴胺可抑制胃癌細胞生長并誘導(dǎo)凋亡，其機制可能與引起G0/G1期阻滯以及調(diào)節(jié)以上2種基因的表達有關(guān)。

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