付 偉，嚴 旭，王 超，潘建偉

(浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004)

生長素(auxin)是調(diào)控植物生長發(fā)育最重要的植物激素之一，生長素極性運輸(polar auxin transport，PAT)是所有已知植物激素特有的一種運輸方式，在植物胚胎、側生器官的發(fā)生與發(fā)育、向性生長(tropism)中起著關鍵性的調(diào)控作用［1-3］，已成為植物發(fā)育生物學領域中研究的熱點之一.生長素極性運輸是由質(zhì)膜定位的輸入載體AUX1/LAX 家屬(auxin resistant 1/like AUX1 family)［4］、輸出載體ABC(ATP-binding cassette transporters，multidrug resistance/p-glycoproteins，MDR/PGP)［5］和PIN 家屬(PINFORMED family)［6］協(xié)同完成的，其中PIN 蛋白在質(zhì)膜上的極性定位在很大程度上決定了生長素的極性流向和梯度分布［7-8］，而生長素通過抑制PIN 蛋白的內(nèi)吞(endocytosis)促進自身的極性輸出［9-10］.生長素的不對稱分布在植物胚胎發(fā)生、器官發(fā)育、向性生長過程中起著重要的作用［11-14］.然而，生長素調(diào)控PIN蛋白內(nèi)吞的分子機理仍不是十分清楚.如:生長素是組成型地抑制PIN 蛋白內(nèi)吞，還是僅僅瞬時抑制其內(nèi)吞?目前還沒有明確的定論.

擬南芥PIN2 主要在根尖表皮細胞和皮層細胞表達，通過介導生長素極性運輸精細調(diào)控植物根尖的向地性(gravitropism)生長和在土壤中的生長方向［14-15］.因此，深入研究生長素調(diào)控PIN2 的質(zhì)膜定位、胞內(nèi)運輸(intracellular trafficking)和降解，對正確理解植物根的向地性生長和根系發(fā)育的分子機制具有重要的生物學意義.本研究主要觀察了外源生長素長時間處理對擬南芥質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度的影響，以及外源生長素調(diào)控PIN2-GFP 內(nèi)吞、胞內(nèi)運輸及其降解的情況.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與生長條件

本研究所用野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)為Col-0(Columbia-0)，分子標記PIN2∶∶PIN2∶GFP轉(zhuǎn)基因植株［16］和生長素受體四突變體tir1-1afb1-1afb2-1afb3-1(tir1afb1，2，3)［17］分別由Ben Scheres 和Mark Estelle 實驗室提供.將PIN2∶∶PIN2∶GFP 與tir1afb1，2，3 四突變體雜交，根據(jù)綠色熒光蛋白(GFP)熒光、突變體表型和聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定結果，獲得PIN2∶∶PIN2∶GFP tir1afb1，2，3 純合株系［10］.

擬南芥種子經(jīng)表面消毒后，在4 ℃黑暗處理3 d，然后在含1.5%瓊脂1/2MS(Sigma 公司)培養(yǎng)基表面萌發(fā)，培養(yǎng)皿豎直放置.生長條件為:24 ℃16 h 光照/22 ℃8 h 黑暗，70%～80%相對濕度和6 000 lx光照強度.萌發(fā)5 d 后的幼苗根用于本研究的所有實驗.對于四突變體，挑選生長相對較好的四突變體幼苗根用于實驗.

1.2 實驗處理

本研究所用的生長素IAA(吲哚-3-乙酸，indole-3-acetic acid)，1-NAA(1-萘乙酸，naphthalene-1-acetic acid)，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸，2，4-dichlorophenoxy acetic acid)和液泡H+-ATPase 抑制劑ConA(Concanamycin)等均購自Sigma 公司.氰化鉀(KCN)由本學院藥品保管室提供.

生長素母液配制:將IAA，1-NAA 和2，4-D 首先用幾滴1 mol/L KOH 溶液溶解，再用去離子水稀釋到10 mmol/L，過濾滅菌后分裝保存于－20 ℃?zhèn)溆茫?0，18］.本研究所用的生長素工作濃度均為10 μmol/L.

ConA 用二甲基亞砜(DMSO)溶解，母液濃度為10 mmol/L，工作濃度為5 μmol/L.

實驗具體方法如下:在正常室溫和光照條件下，1)將萌發(fā)5 d 的幼苗在含有外源生長素的1/2MS液體培養(yǎng)基中處理8 h;2)將萌發(fā)5 d 的幼苗分別在4 ℃1/2MS 液體培養(yǎng)基和含有1 mmol/L KCN 的1/2MS液體培養(yǎng)基中預處理0.5 h，再加入2，4-D 處理8 h;3)將萌發(fā)5 d 的幼苗在5 μmol/L ConA 液體培養(yǎng)基中預處理0.5 h，再加入2，4-D 處理8 h.上述處理結束后，用新的1/2MS 液體培養(yǎng)基快速漂洗2 次，激光共聚焦顯微鏡掃描根尖表皮細胞.

1.3 激光共聚焦顯微分析和數(shù)據(jù)處理

本研究所使用的激光共聚焦顯微鏡型號為Leica TCS SP5 AOBS，用于GFP 熒光觀察的激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為510 nm.所有實驗均在相同設置下完成，并獨立重復3 次.用Image J 軟件對PIN2-GFP 質(zhì)膜信號或胞內(nèi)總信號進行定量分析，用胞內(nèi)總信號表示液胞內(nèi)的PIN2-GFP 積累.定量結果用t-檢驗(雙尾)進行顯著性差異分析，并將對照處理組的PIN2-GFP 信號強度表示為100%.

2 結果

2.1 外源生長素對質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度的影響

已有研究表明，外源生長素短時間(2 h)處理野生型擬南芥(Col-0)根尖，能快速抑制根尖表皮細胞PIN2 內(nèi)吞，從而促進質(zhì)膜PIN2 豐度和生長素的極性輸出［9-10］.然而，本研究預實驗中，用外源生長素2，4-D處理不同時間(0，2，4，6 和8 h)，發(fā)現(xiàn)8 h 處理后，與對照相比，根尖質(zhì)膜PIN2-GFP 信號顯著性下降(圖略).因此，本研究用不同的外源生長素IAA，1-NAA 和2，4-D 分別處理8 h 后，發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜PIN2-GFP 信號均明顯下降(見圖1(a)).定量分析結果表明，與對照處理相比，外源生長素處理均顯著性下調(diào)質(zhì)膜PIN2-GFP 的豐度(t-檢驗，P ＜0.000 1.見圖1(b)).這一結果暗示，外源生長素長時間處理可促進PIN2-GFP 內(nèi)吞，從而下調(diào)質(zhì)膜PIN2-GFP 的豐度.

圖1 外源生長素處理8 h 對質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度的影響

2.2 低溫和KCN 抑制生長素誘導的質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)

圖2 低溫和KCN 抑制外源生長素誘導的質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)

已有文獻報道，細胞內(nèi)吞需要消耗腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，低溫和KCN 通過抑制ATP 的產(chǎn)生而有效地阻礙細胞膜蛋白的內(nèi)吞［19］.如果外源生長素誘導質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)是通過內(nèi)吞途徑，預期低溫和KCN 能抑制生長素誘導的PIN2-GFP 豐度下調(diào).實驗結果如圖2 所示，與對照處理相比，低溫和KCN 顯著性抑制了2，4-D 誘導的PIN2-GFP 豐度下調(diào)(t-檢驗，P ＜0.01 和P ＜0.001.見圖2(b)).同樣，低溫和KCN 也能顯著抑制IAA 或1-NAA 誘導的PIN2-GFP 豐度下調(diào)(圖略).這些結果表明，外源生長素誘導質(zhì)膜PIN2-GFP 水平下調(diào)是通過質(zhì)膜內(nèi)吞途徑.從激光共聚焦顯微鏡觀察和定量分析結果看，低溫抑制質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)的程度明顯高于KCN 的抑制效果(見圖2(b))，這可能是由于KCN的工作濃度不是最佳濃度.

2.3 TIR1/AFB 介導的信號途徑誘導質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)

已知生長素通過其受體TIR1/AFB 介導的信號途徑調(diào)控下游基因的表達.最近的研究表明，TIR1/AFB介導的信號途徑參與調(diào)控PIN2 蛋白的內(nèi)吞或與胞內(nèi)運輸有關［10，20］.因此，為進一步研究外源生長素是否通過其受體TIR1/AFB 介導的信號途徑誘導質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)，將PIN2∶∶PIN2-GFP分子標記與生長素受體四突變體tir1afb1，2，3 雜交，獲得PIN2∶∶PIN2-GFPtir1afb1，2，3 純合株系.用外源生長素2，4-D 分別處理野生型PIN2∶∶PIN2-GFP 和四突變體PIN2∶∶PIN2-GFP 純合株系幼苗，結果發(fā)現(xiàn):在沒有外源生長素的情況下，tir1afb1，2，3 四突變體的質(zhì)膜PIN2-GFP 水平顯著性高于野生型擬南芥(t-檢驗，P ＜0.01.見圖3 中A 和C);在外源生長素2，4-D 存在的情況下，2，4-D 顯著性地誘導了野生型擬南芥質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度的下調(diào)(t-檢驗，P ＜0.001)，但未能有效誘導tir1afb1，2，3 四突變體質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度的下調(diào)(t-檢驗，P ＞0.05.見圖3 中B 和D).這些結果表明，外源生長素通過TIR1/AFB介導的信號途徑調(diào)控質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度，生長素受體TIR1/AFB 突變促進PIN2-GFP 質(zhì)膜定位.

圖3 外源生長素通過TIR1/AFB 介導的信號途徑下調(diào)質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度

2.4 生長素促進PIN2-GFP 在液泡中降解

已知質(zhì)膜定位的PIN2-GFP 經(jīng)內(nèi)吞途徑進入細胞內(nèi)后，一部分PIN2-GFP 通過再循環(huán)途徑又回到質(zhì)膜，其余的PIN2-GFP 則被運輸?shù)揭号輧?nèi)降解［18，21］.本研究結果已經(jīng)表明，在無外源生長素的情況下，四突變體的胞內(nèi)PIN2-GFP 信號明顯強于野生型，暗示生長素受體TIR1/AFB 突變后很可能影響了PIN2-GFP 的胞內(nèi)運輸或液泡內(nèi)降解.

在光照條件下，PIN2-GFP 蛋白進入液泡后迅速被降解，因此很難觀察到PIN2-GFP 在液泡內(nèi)的積累［21］.利用液泡H+-ATPase 抑制劑ConA 能有效地抑制液泡的降解功能［22］，可用來分析PIN2-GFP 在液泡內(nèi)的積累水平.如圖4 所示:用ConA 處理野生型和四突變體幼苗，可明顯地看到大小不同的液泡內(nèi)均有PIN2-GFP 的積累(見圖4 中A，B，D 和E);在野生型擬南芥中，能觀察到外源生長素2，4-D 明顯地促進了PIN2-GFP 在液泡中的積累(見圖4 中B 和C)，但在四突變體中未能觀察到這種促進效應(見圖4 中E 和F);進一步地定量統(tǒng)計分析表明，2，4-D 能顯著性地促進野生型擬南芥PIN2-GFP 的液泡積累(t-檢驗，P ＜0.01)，但在四突變體中沒有顯著性差異(t-檢驗，P ＞0.05)(見圖4(b)).這一結果暗示，外源生長素通過TIR1/AFB 介導的信號途徑促進PIN2-GFP 在液泡中的降解.

圖4 外源生長素促進PIN2-GFP 在液泡中積累

3 討論

本研究結果表明，外源生長素通過TIR1/AFB 介導的信號途徑調(diào)控生長素輸出載體PIN2-GFP 的質(zhì)膜豐度、內(nèi)吞、胞內(nèi)運輸和降解.這一結果與文獻［20］的報道基本一致，但似乎與外源生長素抑制PIN2-GFP 內(nèi)吞的報道［9-10］相矛盾.這有2 種可能:1)外源生長素短時間(2 h)處理與長時間(8 h)處理可能啟動了植物細胞的不同響應機制，表現(xiàn)為外源生長素在不同時間段有不同的生物學功能，如早期抑制內(nèi)吞和后期促進內(nèi)吞2 個截然不同的調(diào)控機制;2)外源生長素早期抑制PIN2 內(nèi)吞，但到后期可能激活了與原先不同的內(nèi)吞途徑，從而通過別的內(nèi)吞途徑促進PIN2 的內(nèi)吞、胞內(nèi)運輸和降解.但這些假設仍需要用進一步的實驗來證明.

絕大部分植物質(zhì)膜蛋白經(jīng)內(nèi)吞途徑進入胞內(nèi)，然后再通過胞內(nèi)運輸途徑輸送到液泡內(nèi)進行降解［18］.本研究結果證明了外源生長素通過TIR1/AFB 介導的信號途徑誘導質(zhì)膜PIN2-GFP 豐度下調(diào)，促進PIN2-GFP 在液泡內(nèi)積累與降解，但目前仍然不清楚TIR1/AFB 介導的信號途徑的具體作用位點，即從內(nèi)吞到液泡膜、從液泡膜到液泡腔、或兩者兼而有之?因此，仍需要進一步的分子證據(jù)來證明這些細節(jié).

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