張小姣 曹 炬 黃世峰 張莉萍

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶400016)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii，AB)為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，屬于條件致病菌。該菌是唯一能在人類皮膚表面生存的革蘭陰性桿菌，對濕熱、紫外線、化學(xué)消毒劑和外界環(huán)境有較強(qiáng)抵抗力。它是院內(nèi)感染的重要病原菌之一，其耐藥率也呈逐年上升趨勢［1-3］，甚至出現(xiàn)了對碳青霉烯酶和多粘菌素耐藥的菌株［4-6］。由于抗菌藥物的局限性越來越明顯，因此，必須積極開發(fā)新的藥物來防治多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的感染。疫苗可能是一個(gè)未來的研究方向。

國外有研究報(bào)道其全菌疫苗，但安全性差，亟待開發(fā)更為安全的蛋白疫苗。外膜蛋白A(Out membrane protein A，OmpA)是一個(gè)分子量大小為38 kD，氨基酸保守性大于99%的蛋白質(zhì)，是目前功能研究最確定的毒力因子［7］;同時(shí)，它也是含有豐富抗原位點(diǎn)的外膜蛋白，能引起上皮細(xì)胞免疫應(yīng)答信號通路表達(dá)上調(diào)。由此，該蛋白可能是一個(gè)良好的候選蛋白疫苗［8］。本研究構(gòu)建 OmpA的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，經(jīng)鎳柱親和層析獲得純化蛋白。并分析該基因在各臨床菌株中的保守性以及討論了該蛋白作為鮑曼不動(dòng)桿菌單位疫苗的前瞻性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 19606)購自美國菌種保藏中心;DH5α、pET28a(+)和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑盒 Premix購自大連寶生物公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司;限制性內(nèi)切酶 BanHⅠ、HindⅢ 以及 T4連接酶購自NEB;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠(人)IgG抗體購自中杉生物公司;引物合成由上海英駿公司合成;Ni-NTA蛋白純化試劑盒購自Novagen;弗氏佐劑購自Sigma公司;其余生化試劑均購自國內(nèi)試劑公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠，SPF級，雌性，6～8周齡，體重18～22克購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 pET28a(+)原核表達(dá)載體的構(gòu)建ATCC19606細(xì)菌培養(yǎng)16～18小時(shí)，提取DNA，擴(kuò)增OmpA蛋白編碼基因。上游引物:5'-ACAGGATCCATGAAATTGAGTCGTATT-3'，下游引物 5'-ACAAGCTTTTATTGAGCTGCTGCA-3'。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5分鐘，94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 1分鐘，循環(huán)次數(shù)30次，72℃延伸10分鐘。利用PCR純化試劑盒將產(chǎn)物和提取的質(zhì)粒純化，根據(jù)引物設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶BanHⅠ和HindⅢ，對純化的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物在T4連接酶的作用下進(jìn)行體外連接，與感受態(tài)E.coil(DH5α)作用后，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)菌。用LB平板(含卡那霉素)初步篩選獲得該質(zhì)粒的菌株，挑選單個(gè)菌落進(jìn)行酶切鑒定并送測序。提取構(gòu)建成功的質(zhì)粒，同樣通過轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，獲得含目的基因的表達(dá)菌株。經(jīng)比對，重組質(zhì)粒pET28a(+)/OmpA測序結(jié)果與GeneBank報(bào)道序列完全一致。

1.2.2 OmpA蛋白的原核表達(dá)條件優(yōu)化 取BL21重組表達(dá)菌株，同時(shí)以含有空載體的菌株作對照，分別挑取單菌落至3 ml液體LB培養(yǎng)基(含50 μg/ml卡那霉素)，37℃培養(yǎng)過夜。取2 ml菌液于10 ml新鮮LB培養(yǎng)基中(含50 μg/ml卡那霉素)，37℃、200 r/min 培養(yǎng)至 OD600=0.6 ～0.7，加入 IPTG 至終濃度分別為 0.5、0.8、1.0、1.3、1.5 mmol/L。誘導(dǎo)5小時(shí)后吸取1 ml菌液，離心，沉淀懸浮于200 μl ddH2O中，以1∶4的比例加入5×SDS樣品緩沖液，100℃煮沸5分鐘后，上樣，SDS-PAGE電泳觀察重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)水平。同樣按照上述方法，在最佳誘導(dǎo)濃度的條件下，收集誘導(dǎo)時(shí)間為3、4、5、6小時(shí)的菌液，SDS-PAGE電泳觀察重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)水平。誘導(dǎo)劑量和時(shí)間固定后，在25℃和37℃的溫度下誘導(dǎo)，觀察不同溫度的誘導(dǎo)水平。最后，根據(jù)以上表達(dá)條件優(yōu)化，確定重組蛋白為上清或包涵體表達(dá)。

1.2.3 重組蛋白的純化 重組菌大量誘導(dǎo)表達(dá)OmpA蛋白，收集后菌體以3 g/ml懸浮在結(jié)合緩沖液中，超聲破碎20～30分鐘，12 000 r/min，10分鐘離心取上清。將純化柱用結(jié)合緩沖液平衡后，在樣本中加入10 mmol/L的咪唑后上樣，可以降低非特異性蛋白與鎳柱結(jié)合。用含50 mmol/L咪唑的漂洗緩沖液洗柱去除雜蛋白，最后用10 ml洗脫緩沖液洗脫并收集目的蛋白。蛋白洗脫液通過超濾管(按照Minipore說明書)減少咪唑和鹽離子濃度，上樣前測蛋白質(zhì)濃度和SDS-PAGE觀察純化效果。

1.2.4 OmpA基因保守性的檢測 以臨床分離的20株菌株為模板，上訴引物為擴(kuò)增條件，擴(kuò)增該菌種的OmpA基因。

1.2.5 抗血清的收集和 Western blot 領(lǐng)取6～8周左右的 BALB/c雌性小鼠10只，分別在1、7、21天免疫小鼠。純化蛋白與弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑按比例混合并乳化，最后得到蛋白濃度為50 μg/μl。每次注射蛋白佐劑乳化物200 μl(含10 μg OmpA)。免疫后1周，取小鼠心臟血，10 000 r/min，離心取小鼠血清。保存于－20℃?zhèn)溆?。臨床不同基因型別(PFGE不同分型)的五株臨床菌株為樣本，小鼠血清作為一抗，羊抗鼠IgG作為二抗，ECL顯色的方法檢測小鼠血清對臨床菌株的抗原抗體保護(hù)作用。

1.2.6 重組蛋白免疫小鼠后的生存率觀察

1.2.6.1 小鼠攻毒細(xì)菌劑量確定 為了增加細(xì)菌毒力，我們用臨床分離的一株鮑曼不動(dòng)桿菌A腹腔攻毒小鼠，兩小時(shí)后觀察到小鼠發(fā)病，如弓背，豎毛時(shí)，剪開小鼠胸腔，進(jìn)行無菌心臟取血。血液在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，LB培養(yǎng)基上長出純菌落，經(jīng)梅里埃vitek-compact鑒定儀鑒定，此菌為鮑曼不動(dòng)桿菌。將該菌在LB液體培養(yǎng)基中增菌16～18小時(shí)，PBS洗滌3次后調(diào)整菌液濃度分別為1.25×108、2.5×108、5×108CFU/ml。9 只小鼠分成 3 組，每組3只，按照以上3個(gè)菌液濃度，每只200 μl腹腔注射。觀察發(fā)現(xiàn)最高濃度劑量組小鼠兩天內(nèi)死亡，其余小鼠14天內(nèi)存活，確定該實(shí)驗(yàn)中此菌致小鼠死劑量為1×108CFU。

1.2.6.2 小鼠生存率計(jì)算 領(lǐng)取6～8周左右的BALB/c雌性小鼠20只。10只免疫蛋白劑量和步驟同前，剩余10只以弗氏佐劑和PBS免疫小鼠做對照。第三次免疫小鼠1周后，以腹腔注射方式給予鮑曼不動(dòng)桿菌菌株A:1×108CFU，觀察小鼠21天生存率。各組小鼠生存率用Fisher進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。

1.2.7 病人血清中OmpA抗體檢測 OmpA蛋白濃度稀釋為5 μg/L，每孔100 μl，4℃過夜包被在空白ELISA 96孔板，甩干包被液體，1%BSA封閉1小時(shí)。人血清為樣本，稀釋濃度分別為1∶100、1∶200、1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶10 000、1 ∶20 000。每孔加 100 μl稀釋血清，37℃孵育2小時(shí)。HRP酶標(biāo)二抗37℃孵育1小時(shí)。顯色劑顯色15～20分鐘，酶標(biāo)儀讀取A450吸收值。

2 結(jié)果

2.1 OmpA基因蛋白編碼區(qū)的擴(kuò)增 提取ATCC19606 DNA，按照上述反應(yīng)條件擴(kuò)增OmpA的基因(1 071 kb)，結(jié)果表明擴(kuò)增片段大小與預(yù)期值相符(如圖1示)。

2.2 OmpA/pET28a(+)原核表達(dá)載體的酶切鑒定構(gòu)建質(zhì)粒酶切后跑瓊脂糖凝膠電泳，如圖2示，酶切后目的基因和質(zhì)粒被切開，顯示重組載體構(gòu)建成功。陽性克隆株送英駿公司測序結(jié)果與OmpA基因序列一致，編碼基因大小為1 071 kb。

圖1 OmpA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products for OmpA

2.3 重組蛋白的表達(dá)和純化 通過改變誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度來確定OmpA的最佳表達(dá)條件。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該蛋白的最佳表達(dá)條件為:25℃，誘導(dǎo)劑濃度為1.3 mmol/L，誘導(dǎo)5小時(shí)，此時(shí)上清表達(dá)量最高。裂菌液上清經(jīng)過Ni-NTA純化，純化后的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE和凝膠成像分析軟件分析，純度可達(dá)90%以上，Bardford法測得超濾后蛋白濃度為0.4 mg/ml(圖3)。

2.4 基因保守性檢測 我們隨機(jī)選取了20株臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌擴(kuò)增OmpA基因，結(jié)果顯示(如圖4)所選取的菌株都能擴(kuò)增出基因，提示該基因的保守性較好。

2.5 Western blot分析鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA蛋白保守性 純化重組蛋白免疫了小鼠后獲得了多克隆抗體血清。我們選取了臨床分離的五個(gè)不同基因型別的臨床菌株(PFGE分型)和 ATCC19606，發(fā)現(xiàn)OmpA在各菌株中都有表達(dá)(如圖5)，提示該蛋白保守性較高，且抗體血清能夠識別和結(jié)合臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌。

2.6 小鼠生存率觀察 小鼠生存率結(jié)果如圖6所示。蛋白免疫組小鼠生存率顯著高于對照組 (P＜0.05)。結(jié)果提示，重組蛋白 OmpA免疫 BALB/c小鼠可以對抗A.baumanni的腹腔感染。

2.7 正常人血清OmpA抗體檢測 我們檢測了7例鮑曼不動(dòng)桿菌定植病人和6例體檢人員的血清抗OmpA抗體，兩者抗體水平無明顯差異(如圖7)，顯示人群中含有OmpA抗體，它不會(huì)與自身抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。

圖2 重組表達(dá)載體的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant of pET28a(+)/OmpA

圖3 重組蛋白純化SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis for recombinant OmpA protein

圖4 20株臨床菌株OmpA擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.4 PCR products for OmpA gene of 20 clinical strains

圖5 Western blot分析OmpA在各菌株中的表達(dá)Fig.5 Western blot analysis for OmpA expression in some A.baumanni

3 討論

圖6 主動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)小鼠生存率結(jié)果(P＜0.05)Fig.6 Vaccination with rOmpA protected mice from lethal A.baumannii intraperitoneal infection(P＜0.05)

圖7 人血清OmpA抗體滴度Fig.7 The antibody titers of OmpA in human serum

由于抗生素治療的有限性，因此，必須積極開發(fā)新的藥物來防治多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的感染。接種疫苗就是一種最有潛力和期待的方式。有文獻(xiàn)報(bào)道用減毒的死菌體和外膜蛋白復(fù)合物作為免疫原研究該疫苗的有效性［9，10］。雖然它們有豐富的抗原位點(diǎn)和較強(qiáng)的保護(hù)效能，但是應(yīng)該考慮前者的安全性和后者制作成本太高等不足。A.baumannii OmpA是一個(gè)優(yōu)質(zhì)的具有前瞻性的疫苗候選蛋白，已有文獻(xiàn)報(bào)道其作為抗原免疫小鼠后，小鼠脾細(xì)胞因子水平上升證明該免疫蛋白的免疫原性［11］。

作為一個(gè)良好的亞單位蛋白抗原，必須具備高度的保守性并與人體自身抗原的氨基酸序列幾乎無同源性［12］。在本實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了OmpA蛋白在基因水平和蛋白表達(dá)水平的高度一致性。經(jīng)酶切鑒定和基因測序結(jié)果顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA基因片段被正確克隆到 pET-28a(+)原核表達(dá)載體中。OmpA基因片段的核苷酸序列長度為1 071 bp，與GeneBank中序列相一致，無堿基突變。重組工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在BL21(DE3)菌中表達(dá)出了分子量約為38 kD的rOmpA融合蛋白。重組蛋白主要以可溶形式表達(dá)在上清液，經(jīng) Ni-NTA樹脂純化后得到了純度＞90%的重組蛋白。有文獻(xiàn)報(bào)道該蛋白在氨基酸序列上具有99%的一致性［11］。該報(bào)道收集了6株不同型別的菌株，菌株收集時(shí)間跨越了1951～2009年間隔五十幾年的時(shí)間，而且分離自不同的臨床樣本，包括腦脊液、肺部、血液、傷口分泌物。發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的相似性＞99%。通過比對Pubmed一些不同序列的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株發(fā)現(xiàn)89%的全菌基因序列相一致。相反，本研究過程中通過BLAST比對，ATCC19606 OmpA序列與人的基因序列幾乎不具有同源性。由此證明，OmpA基因保守性高度一致，而與人的同源性非常小，是一個(gè)良好的的亞單位蛋白候選疫苗。

同時(shí)，A.baumannii OmpA是一個(gè)重要的膜孔蛋白，在細(xì)菌感染的病理過程中發(fā)揮著重要的作用。它能激活抗原提呈細(xì)胞——樹突細(xì)胞，后者使CD4+T細(xì)胞分化成為 Th1細(xì)胞，激活并放大免疫反應(yīng)［13］。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道鮑曼不動(dòng)桿菌通過外膜小泡分泌和傳遞致病因子給宿主細(xì)胞，并評估了外膜小泡中OmpA的毒性活性，結(jié)果顯示有OmpA的外膜小泡導(dǎo)致宿主細(xì)胞凋亡，而OmpA突變體未能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由此說明，如果通過抗體阻斷OmpA對上皮細(xì)胞的粘附與損傷，就能大大降低細(xì)菌對機(jī)體的侵襲力［14］。在我們的小鼠生存率實(shí)驗(yàn)中，免疫小鼠的生存時(shí)間明顯長于對照組小鼠，生存率也高于對照組，說明免疫小鼠在一定程度上能夠抵抗鮑曼不動(dòng)桿菌的侵襲。因此，OmpA是一個(gè)良好的候選疫苗蛋白。

本實(shí)驗(yàn)研究了A.baumannii OmpA基因的保守性，在分離的20株臨床菌株中都有該基因的表達(dá)。在蛋白水平上，免疫后的小鼠血清均能識別臨床菌株，結(jié)果顯示免疫小鼠能產(chǎn)生該蛋白特異性的多克隆抗體，并能與臨床菌株發(fā)生抗原抗體反應(yīng)?；蛩胶偷鞍妆磉_(dá)水平均具有良好的保守性，是作為一個(gè)良好的亞單位蛋白疫苗的前提。此外，正常人群中也檢測到該蛋白的抗體滴度，可能是正常人上呼吸道定植了鮑曼不動(dòng)桿菌，當(dāng)機(jī)體免疫力低下的時(shí)候可引起致病，也有可能是人體本身攜帶的其他正常細(xì)菌體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)作用，結(jié)果說明人群中含有OmpA抗體，它不會(huì)與自身抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。綜上所述，OmpA具有作為亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)，是鮑曼不動(dòng)桿菌良好的疫苗靶點(diǎn)。亞單位疫苗由于抗原位點(diǎn)的局限性，在以后的研究中希望能找到更多的亞單位蛋白分子制成聯(lián)合疫苗，大大提高疫苗的保護(hù)效果。

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