吳 超，李潤航，于中英，婁玉杰

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

在人們健康意識不斷增強的今天，膽固醇往往片面的被認(rèn)為是對人體有害的物質(zhì)，但實際上，膽固醇是動物細(xì)胞各種膜結(jié)構(gòu)及神經(jīng)髓鞘的重要組成部分，可調(diào)節(jié)腸胃消化道中膳食脂肪的吸收，是膽汁酸、類固醇激素及維生素D3的前體，具有重要的生理功能[7]，但如果攝入量過多，可形成高血脂癥，引起動脈粥樣硬化，進(jìn)而誘發(fā)冠心病、高血壓等一系列心腦血管疾病[1-4]。研究表明，來源于雞蛋中的膽固醇與來源于其他原料的膽固醇相比更易導(dǎo)致人體血清膽固醇水平的提高[5-6]。雞蛋中的膽固醇總量在100～270 mg范圍內(nèi)變動[7]，為滿足不同人群的需要，低膽固醇雞蛋備受人們的關(guān)注，因而雞蛋中膽固醇含量測定的方法及準(zhǔn)確性是評定其營養(yǎng)價值的重要參數(shù)。本文對雞蛋膽固醇的測定方法進(jìn)行了比較研究，旨在比較兩種測定方法之間存在的差異，為雞蛋膽固醇含量的測定提供方法指導(dǎo)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用的雞蛋來源于依莎褐蛋雞產(chǎn)的新鮮褐殼雞蛋20枚，中華綠蛋雞產(chǎn)的新鮮綠殼雞蛋20枚。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.0%(上海科敏生物科技有限公司，貨號ALD0762)。

1.2 試驗方法

1.2.1 鄰苯二甲醛比色法

1.2.1.1 樣品前處理 取雞蛋稱量全蛋重，分離蛋黃，稱量蛋黃重，然后稱取 1 g蛋黃于研缽中，加入甲醇、氯仿混合液約5 mL，研磨10 min，過濾于刻度試管中，并用甲醇、氯仿混合液沖洗研缽和玻璃棒3次，定容至10 mL，作為樣品濾液，待用。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品100 mg溶于冰乙酸定容至1 000 mL制成標(biāo)準(zhǔn)膽固醇應(yīng)用液(0.1 mg/mL)。取5只試管，編號，按表1加入試劑。加畢，震蕩混勻，靜置10 min, 用721型分光光度計于550 nm測定吸光值，以膽固醇含量為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的吸光度值計算樣品中膽固醇含量。

1.2.2 氣相色譜法

1.2.2.1 樣品前處理 取雞蛋稱全蛋重，分離蛋清蛋黃，稱蛋黃重，稱取1 g蛋黃樣品，放入圓底燒瓶中，然后加2 mol/L的KOH和無水乙醇混合溶液25 mL，攪拌均勻，在恒溫水浴鍋中保持85 ℃，加熱皂化60 min，皂化過程中，反復(fù)振蕩至均勻。皂化液冷卻至室溫，加去離子水25 mL移至100 mL分液漏斗中，分3次石油醚提取，每次提取20 mL，合并石油醚提取液，用蒸餾水多次洗凈石油醚層至pH為中性，然后用無水硫酸鈉脫水，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通氮氣吹干石油醚，最后把樣品在水浴鍋上蒸干并用1 mL無水乙醇復(fù)溶，稀釋，作為氣相色譜法的分析樣品。

表1 鄰苯二甲醛法測定膽固醇-標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Table 1 Determination of cholesterol using the OPA method-the standard curve

1.2.2.2 蛋黃膽固醇的測定 色譜柱條件采用氣相色譜儀進(jìn)行測定(FID檢測器：290 ℃；進(jìn)樣口：280 ℃；色譜柱：DB-5彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm；柱箱溫度：初始溫度為200 ℃，保持1 min,以30 ℃/min升溫至280 ℃，保持10 min。進(jìn)樣量為 1 μL。

稱取 20 mg 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)膽固醇貯備液(2 mg/mL)。將標(biāo)準(zhǔn)貯備液用正己烷稀釋，配制0.2、0.5、1.0、和2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，注入氣相色譜儀，按上述氣相(Gas chromatography，GC) 色譜條件分析，以膽固醇含量(X) 為橫坐標(biāo)，峰面積(Y) 為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 17.0對氣相色譜法和比色法的結(jié)果進(jìn)行配對樣本t檢驗和對綠殼蛋和褐殼蛋的膽固醇含量進(jìn)行獨立樣本t檢驗，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 比色法測定雞蛋中膽固醇含量

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的雞蛋中膽固醇含量見表2。由表2可知，采用鄰苯二甲醛分光光度計比色法測定褐殼蛋和綠殼蛋的膽固醇含量分別為176.79 mg/枚和158.12 mg/枚，褐殼蛋膽固醇含量較綠殼蛋高出11.80%，差異顯著(P<0.05)。

表2 鄰苯二甲醛比色法測定雞蛋黃膽固醇含量結(jié)果Table 2 Egg cholesterol values determined by OPA method

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Values with different lowercase superscripts indicate significant differences (P<0.05). The same below.

2.2 氣相色譜法測定雞蛋中膽固醇含量

膽固醇含量的測定見表3。由表3可知，在本試驗條件下，采用氣相色譜法測定褐殼蛋和綠殼蛋中膽固醇含量分別為142.74 mg/枚和128.7 mg/枚，褐殼蛋膽固醇含量較綠殼蛋高出10.90%，差異顯著(P<0.05)。

2.3 兩種方法測定雞蛋中膽固醇含量比較

兩種方法測定雞蛋中膽固醇含量的比較結(jié)果見表4。由表4知，比色法與氣相色譜法對褐殼蛋蛋黃膽固醇濃度測定分別為13.35 mg/g和9.69 mg/g，前者顯著高出后者達(dá)到27.42% (P<0.05)；雞蛋膽固醇含量分別為176.79 mg/枚和142.74 mg/枚，前者較后者高出19.26%，差異顯著(P<0.05)。用比色法與氣相色譜法對綠殼蛋進(jìn)行測定，蛋黃膽固醇濃度測定分別為10.65 mg/g和8.54 mg/g，前者顯著高出后者達(dá)到19.81% (P<0.05)；雞蛋膽固醇含量分別為158.12 mg/枚和128.7 mg/枚，前者較后者高出18.61%，差異顯著(P<0.05)。

圖1 氣象色譜測定雞蛋中膽固醇 A.標(biāo)準(zhǔn)品;B.綠殼雞蛋;C.褐殼雞蛋Fig.1 Egg cholesterol values determined by GC method A.Stardard;B.green-shell egg;C.Brow-shell egg

表3 氣相色譜法測定綠殼蛋和褐殼蛋的蛋黃膽固醇含量Table 3 Egg cholesterol values determined by GC method

表4 鄰苯二甲醛比色法和氣相色譜法測定膽固醇含量比較Table 4 Egg cholesterol values determined by GC method and OPA method

3 討 論

3.1 褐殼蛋與綠殼蛋中膽固醇含量比較分析

褐殼蛋是市場上銷售較多的雞蛋，該品種雞為大規(guī)模工廠化生產(chǎn)管理，配合飼料、全價營養(yǎng)，具有產(chǎn)蛋多、蛋重大、市場售價低的優(yōu)點，但普遍被認(rèn)為膽固醇含量高。試驗選擇的綠殼雞蛋為地方品種雞，具有產(chǎn)蛋少、蛋重小、市場售價高的特點，其飼料的營養(yǎng)成分沒有工廠化飼養(yǎng)的齊全，管理粗放，這可能是人們認(rèn)為其膽固醇含量低的原因之一[8]。

本試驗條件下對比兩種雞蛋膽固醇含量，褐殼蛋顯著高于綠殼蛋，這可能是由于中華綠蛋雞飼養(yǎng)方式(散養(yǎng))以及日糧的結(jié)構(gòu)不同所致。王立克[8]等研究表明用比色法測定褐殼雞蛋膽固醇含量為13.14 mg/g，丁宇霞等[9]報道采氣相色譜法測定褐殼蛋蛋黃中膽固醇含量為9.44 mg/g，高素敏[10]等報道采用比色法測定綠殼蛋蛋黃中膽固醇含量為14.27 mg/g。楊朋坤等[11]用氣相色譜法測定出綠殼雞蛋膽固醇含量7.75 mg/g。這些測定結(jié)果與本試驗的結(jié)果有一定的差異，這與不同品種及其日糧結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系。綠殼蛋的膽固醇含量顯著低于褐殼蛋，說明地方品種雞更具較低膽固醇蛋生產(chǎn)潛力。

3.2 兩種測定雞蛋中膽固醇方法的比較

比色法和氣相色譜法是測定雞蛋膽固醇的主要方法。鄧峰等[12]研究表明，用比色法測定膽固醇含量要高于氣相色譜法的測定結(jié)果，兩者差異極顯著，用比色法與氣相色譜法對綠殼蛋進(jìn)行測定，蛋黃膽固醇濃度前者較后者高出19.81%，雞蛋膽固醇含量高出18.61%。比色法測定膽固醇含量時，測定結(jié)果一般明顯高于氣相色譜法的測定結(jié)果，這可能因為比色法是在特定波長下進(jìn)行顯色分析的，但由于共存脂類也會與顯色劑反應(yīng)而干擾測定結(jié)果[13]。采用氣相色譜法測定膽固醇，與比色法相比選擇性高，分離效果好，可以排除許多干擾因素[14]，這是因為氣相色譜法可將膽固醇與其他成份分開，定量測定。而比色法特異性較差，醋酸和硫酸混合酸的比例及醋酸的揮發(fā)性會影響顯色結(jié)果，所以比色法不適合測定膽固醇[15]。本研究中，用比色法與氣相色譜法對褐殼蛋進(jìn)行測定，對于蛋黃膽固醇濃度前者較后者高出27.42%，而雞蛋膽固醇含量高出19.26%，試驗結(jié)果與前人研究一致。

4 結(jié) 論

采用比色法和氣相色譜法對雞蛋膽固醇含量測定，比色法的測定結(jié)果顯著高于氣相色譜法。氣相色譜法測定蛋黃膽固醇含量方法特異性更強，可以排除若干固醇的干擾，選擇性更高，分離效果更好，更適合用來測定雞蛋膽固醇含量。

參考文獻(xiàn):

[1] 王彥文. 對低膽固醇雞蛋的新認(rèn)識[J]. 國外畜牧科技, 1995, 22(2):35.

[2] 趙連成, 周北幾, 李 瑩，等. 人群血清膽固醇水平與膳食營養(yǎng)的關(guān)系[J]. 中國慢性病預(yù)防與控制，1996,4(5):195-199.

[3] 陳 進(jìn), 王家良, 李寧秀，等. 非藥物干預(yù)對高脂血癥患者降脂效果研究[J]. 中華流行病學(xué)雜志, 2002, 23(2):138-141.

[4] Farran Mt, Mg Uwayjan, Ama Miski, et al. Effect of feeding raw and treated common vetch seed (Vicia sativa) on the performance and egg quality parameters of laying hens [J]. Poultry science, 1995, 74(10):1 630-1 635.

[5] Grundy Scott M. Cholesterol and coronary heart disease[J]. JAMA: the journal of the American Medical Association, 1986, 256(20):2 849-2 858.

[6] 周愛儒, 黃如彬. 醫(yī)學(xué)生物化學(xué)[M]. 北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2004.

[7] 徐叔云, 卞如濂, 陳 修,等.藥理實驗方法學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社，1982.

[8] 王立克, 胡忠澤, 羅學(xué)振，等. 不同品種雞蛋中膽固醇含量的比較研究[J]. 安徽科技學(xué)院學(xué)報, 2006, 20(1):5-7.

[9] 丁宇霞, 任學(xué)聰, 黃 真. GC 測定不同蛋類及不同烹飪方法雞蛋蛋黃中膽固醇的含量[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2012, 18(22):137-139.

[10] 高素敏, 康相濤, 田亞東，等. 盧氏綠殼雞蛋的品質(zhì)評價[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008,6(5):97-99.

[11] 楊朋坤, 盧冉, 田亞東，等. 綠殼蛋和烏雞蛋膽固醇含量的測定[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報, 2011, 32(2):75-78.

[12] 鄧 峰,周英田. 氣相色譜法對蛋黃中膽固醇含量的測定[J]. 營養(yǎng)學(xué)報,1987,9(2):158-163.

[13] 齊永秀, 高允生, 費洪榮，等. 高效液相色譜法測定雞蛋蛋黃中膽固醇含量[J]. 藥物生物技術(shù), 2005, 12(4):258-260.

[14] 梁劍平, 邵伍軍, 魏 恒，等. 氣相色譜法測定駱駝奶中的膽固醇[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2008(1):30-31.

[15] Kaneda T.Quantitative analysis of cholesterol in foods by gas-liquid chro-matography[J]. Nutri Sci vitaninol ,1980：26:497.