魏東，常雅莉，盧錦標(biāo)，胡麗娜，焦磊，王秉翔，王國(guó)治

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis）引起的烈性傳染病。鼠疫菌被列為重要的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑，一直受到高度重視。

傳統(tǒng)的鼠疫疫苗分為滅活疫苗和減毒活疫苗兩類(lèi)，英美等國(guó)家一直使用滅活疫苗，中國(guó)則使用減毒活疫苗，兩種疫苗在疾病預(yù)防及免疫接種方面均存在不足，因此人們尋求一種既具有很好保護(hù)力，注射方式又容易被接受的新型疫苗。美國(guó)等國(guó)家對(duì)組分疫苗進(jìn)行了研究，以期代替?zhèn)鹘y(tǒng)的滅活疫苗和減毒活疫苗。在研究中發(fā)現(xiàn)，鼠疫菌莢膜 F1抗原和毒力因子 V 抗原能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生血清和黏膜抗體應(yīng)答，是抵抗鼠疫菌感染的重要保護(hù)性抗原[1-9]。本研究通過(guò)檢測(cè)鼠疫組分疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的血清抗體及黏膜抗體免疫應(yīng)答，對(duì)其免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為新型鼠疫疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 疫苗成分 F1 抗原、rV 抗原（重組V 抗原）及Al(OH)3佐劑由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第七研究室提供；皮上劃痕用鼠疫活疫苗為蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司產(chǎn)品（批號(hào)：201009006）。

1.1.2 主要試劑 山羊抗小鼠 IgG-HRP 及山羊抗小鼠 IgA-HRP 均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；戊巴比妥鈉為美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c 小鼠 20只，6～8周齡，體重 18～22 g，由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：scxk（京）2009-0017。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中飼養(yǎng)于中國(guó)食品藥品檢定研究院清潔級(jí)動(dòng)物房。

1.2 方法

1.2.1 分組及免疫 將 20只 BALB/c 小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。分別為：①生理鹽水對(duì)照組；②鼠疫疫苗低劑量組（F1、rV 各 15 μg/劑）；③鼠疫疫苗高劑量組（F1、rV 各 45 μg/劑）；④皮上劃痕用鼠疫活疫苗組（含菌 5.0×107/劑）。①～③組0周及2周免疫，注射部位均為后肢肌內(nèi)；第 ④組僅 0周免疫，注射部位為后肢皮下。

1.2.2 樣品采集

1.2.2.1 血清制備 內(nèi)眥采血，離心收集上清，–20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 肺沖洗液制備 將采血后動(dòng)物腹腔注射40 mg/ml 戊巴比妥鈉溶液 0.3ml，動(dòng)物麻醉后剪開(kāi)頸部皮膚，充分暴露氣管，沿氣管上端剪一楔形口，取 2ml 注射器用 0.8ml PBS 沖洗肺臟，反復(fù)抽吸 3 次后收集沖洗液，離心后取上清–20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體檢測(cè) 分別用純化的鼠疫 F1 抗原和rV 抗原包被酶標(biāo)板，抗原濃度均為5μg/ml，每孔加100 μl，4 ℃ 過(guò)夜。次日用洗滌液洗板，重復(fù) 3 次，每孔加入 300 μl 封閉液，37 ℃ 孵育 1 h，用洗滌液洗板，重復(fù) 3 次。血清 IgG、IgA 檢測(cè)時(shí)，①組作 50 倍稀釋?zhuān)谎?IgG 檢測(cè)時(shí)，②、③、④組均從 200 倍開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)谎?IgA 檢測(cè)時(shí)，②、③、④組均從 50 倍開(kāi)始倍比稀釋。肺沖洗液IgG、IgA 檢測(cè)時(shí)，①組作 4 倍稀釋?zhuān)?、③、④組均從 4 倍開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)幻靠准尤胍陨舷♂寴颖?100 μl，37 ℃ 孵育 1 h。洗板 3 次，加入1∶5000 稀釋的山羊抗小鼠 IgG-HRP 或山羊抗小鼠 IgA-HRP 100 μl，37 ℃ 孵育 1 h。洗板 5 次，加入 TMB 顯色液 100 μl，37 ℃ 顯色 5～15 min。每孔加入 2 mol/L 硫酸 50 μl 終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀30 min 內(nèi)讀 OD450nm值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：

⑴陽(yáng)性判定：≥ 2.1×陰性對(duì)照 OD450nm平均值；

⑵效價(jià)的計(jì)算：各待檢樣品陽(yáng)性的最大稀釋倍數(shù)為該動(dòng)物的抗體效價(jià)。幾何平均滴度計(jì)算公式為：

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組動(dòng)物的效價(jià)取以 10 為底的對(duì)數(shù)后進(jìn)行 t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)軟件為Minitab 15 簡(jiǎn)體中文版。

2 結(jié)果

2.1 血清抗 F1 抗原和rV 抗原 IgG 及IgA抗體

2.1.1 血清抗 F1 抗原 IgG 及IgA 抗體 結(jié)果（表1）表明低劑量組、高劑量組以及活疫苗組均能產(chǎn)生較高的抗 F1 抗原 IgG 抗體，各組效價(jià)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；低劑量組、高劑量組以及活疫苗組抗 F1 抗原 IgA 抗體均有陽(yáng)轉(zhuǎn)，但抗體效價(jià)較低。

2.1.2 血清抗 rV 抗原 IgG 及IgA 抗體 低劑量組、高劑量組都能產(chǎn)生較高的抗 rV 抗原 IgG抗體，高劑量組效價(jià)明顯高于低劑量組，但均無(wú)抗rV 抗原 IgA 抗體產(chǎn)生；活疫苗組無(wú)抗 rV 抗原IgG 及IgA 抗體產(chǎn)生。

2.2 肺沖洗液抗 F1 抗原和rV 抗原 IgG 及IgA 抗體

2.2.1 肺沖洗液抗 F1 抗原 IgA 及IgG 抗體結(jié)果（表 2）表明各組均可檢出抗 F1 抗原 IgG 抗體；各組均未檢出抗 F1 抗原 Ig A 抗體。

2.2.2 肺沖洗液抗 rV 抗原 IgG 及IgA 抗體低劑量組、高劑量組均可檢出抗 rV 抗原 IgG 抗體，高劑量組抗體效價(jià)明顯高于低劑量組，但其差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），活疫苗組無(wú)抗 rV 抗原 IgG 抗體產(chǎn)生；各組均未檢出抗 rV 抗原 Ig A抗體。

3 討論

鼠疫菌主要以細(xì)胞外感染為主，保護(hù)性抗體對(duì)抗鼠疫感染具有重要作用[10-11]。本研究將由 F1 抗原和rV 抗原組成的鼠疫組分疫苗免疫小鼠，檢測(cè)血清及肺沖洗液中特異性抗體。血清中可產(chǎn)生較高效價(jià)的抗 F1 抗原和rV 抗原 IgG 抗體以及較低效價(jià)的抗 F1 抗原 IgA 抗體，高劑量組抗體效價(jià)均高于低劑量組，說(shuō)明具有一定量效關(guān)系。V 抗原是一種重要的毒力因子[12]，V 抗原的存在使鼠疫菌具有較強(qiáng)的致病性，而人用疫苗為減毒活疫苗，無(wú)V 抗原表達(dá)，從而失去了一個(gè)較重要的免疫原，活疫苗免疫小鼠后無(wú)抗 V 抗原抗體產(chǎn)生。

表1 血清抗 F1、rV 抗原 IgA 及IgG 抗體效價(jià)幾何均值結(jié)果Table1 The serum titer of anti-F1 and anti-rV

表2 肺沖洗液抗 F1、rV 抗原 IgA 及IgG 抗體效價(jià)幾何均值結(jié)果Table2 The BAL titer of anti-F1 and anti-rV

通過(guò)對(duì)肺沖洗液的檢測(cè)，均無(wú) IgA 產(chǎn)生，但肺沖洗液中可檢測(cè)到抗 F1 抗原和V 抗原的IgG抗體。有文獻(xiàn)報(bào)道鼠疫亞單位疫苗能保護(hù)免疫動(dòng)物氣溶膠的攻擊，并能有效清除肺部的攻擊菌，說(shuō)明該保護(hù)作用除主要源于血清中的抗體外，可能與呼吸系統(tǒng)黏膜的IgG 抗體有關(guān)[13]。國(guó)外研制的由重組F1 抗原和重組V 抗原組成的鼠疫疫苗已完成I 期臨床研究，顯示該疫苗有較好的安全性及免疫原性[14]。國(guó)內(nèi)研制的由天然產(chǎn)物提取的F1 抗原和重組V 抗原組成的鼠疫疫苗也已進(jìn)入 I 期臨床研究。傅林鋒等[15]研究報(bào)道顯示，該疫苗能有效保護(hù)豚鼠抵抗強(qiáng)毒鼠疫桿菌攻擊，存活率可達(dá)到90%。

鼠疫疫苗能較好地誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫應(yīng)答，雖然未能誘導(dǎo)肺泡黏膜產(chǎn)生 IgA 抗體，但能檢測(cè)到一定的IgG 抗體，該疫苗有希望成為我國(guó)新一代鼠疫疫苗。

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