夏 珍， 李菊香， 丁 浩， 孫國芳， 洪 葵， 吳延慶， 程曉曙

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西省分子中心醫(yī)學(xué)重點實驗室，江西南昌330006)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease)，由于冠狀動脈管腔粥樣硬化而狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血和缺氧而引起的心臟病，具有較高的致病率和致死率。心絞痛、心肌梗死和缺血性心臟病等共同的病理基礎(chǔ)都是心肌缺血缺氧，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［1］。因此，如何保護(hù)缺血損傷的心肌細(xì)胞是醫(yī)學(xué)上急待解決的問題。

Bim是Bcl-2家族中僅含BH3結(jié)構(gòu)功能域的重要促凋亡蛋白。DNA損傷、血清饑餓、紫杉醇等刺激均可影響B(tài)im的表達(dá)來引起細(xì)胞的凋亡［2-4］。Bim作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，對于缺氧損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮了怎樣的生物學(xué)作用，是否介導(dǎo)了缺氧刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，目前在國內(nèi)外未見報道。在本研究中，我們首先原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞，通過小干擾RNA技術(shù)沉默bim的表達(dá)，然后建立缺血缺氧損傷模型，觀察Bim在缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用，為今后將Bim作為阻斷缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的靶點奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1．1 動物 出生1～3 d Sprague-Dawley大鼠，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物科學(xué)部提供，動物合格證為醫(yī)動字021-9602。

1．2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco。抗α-橫紋肌肌動蛋白免疫組化試劑盒和FITC羊抗兔IgG購自武漢博士德。MTT細(xì)胞存活率檢測試劑盒購自Ameresco。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司?？偟鞍滋崛≡噭┖匈徸云绽R基因技術(shù)有限公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen。bim-siRNA購自Invitrogen。I抗 Bim、p-p38 MAPK、p38 MAPK、Bax、Bcl-2及β-actin購自Santa Cruz。II抗辣根過氧化物酶IgG購自北京中杉金橋公司。

2 方法

2．1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 取出生1～3 d乳鼠心臟，用含雙抗(青霉素+鏈霉素)的磷酸鹽緩沖液清洗3次，剝除筋膜、脂肪等多余組織，用剪刀將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織，用0.08%胰酶和1．00%Ⅱ型膠原酶消化組織，離心收集細(xì)胞以15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基充分重懸，200目濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液至培養(yǎng)皿，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經(jīng)差速貼壁2 h，使成纖維細(xì)胞貼壁。然后小心吸出未貼壁心肌細(xì)胞懸液接種到放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，加入0．1%BrdU抑制成纖維細(xì)胞的增殖。24 h后第1次換液，48 h后取出玻片，用37℃ PBS漂洗，4%甲醛固定，加大鼠抗α-橫紋肌肌動蛋白單克?、窨?∶50，于4℃濕盒過夜，加FITC羊抗小鼠IgG 1∶50，孵育30 min，緩沖鹽水洗2次，DAPI封片劑染核，顯微鏡下觀察。

2．2 缺氧模型的建立和轉(zhuǎn)染 配置模擬缺氧溶液，以95%N2～5%CO2預(yù)飽和1 h，置換正常培養(yǎng)基，放入缺氧盒中通95%N2～5%CO230 min后密閉缺氧盒，放置于37℃孵箱中缺氧。我們通過前期實驗，發(fā)現(xiàn)Bim在心肌細(xì)胞缺氧12 h表達(dá)最高。將bim-siRNA和陰性對照siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞。按操作說明用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋適當(dāng)量的Lipofectamine 2000和bim-siRNA混合形成轉(zhuǎn)染試劑混合液，加入心肌細(xì)胞密度為90% 的6孔板中，輕輕搖晃混合。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，將心肌細(xì)胞置于缺氧盒中缺氧12 h。實驗分為5組:(1)正常對照組;(2)缺氧組;(3)缺氧+陰性對照siRNA組;(4)缺氧+脂質(zhì)體組;(5)缺氧+bim-siRNA組。Invitrogen公司設(shè)計、合成了3對bim-siRNA序列，將3對bim-siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，篩選沉默效率最高的Bim-siRNA用于后續(xù)實驗。siRNA-1上游引物5’-AACAGAUGUAAGUUAACGAUUUCCG-3’，下游引物5’-UGGUCAAUACUACAUGUGAUACCUU-3’;siRNA-2上游引物 5’-AACAGUUGUAAGAUAACCAUUU-GCG-3’，下游引物 5’-CGCAAAUGGUUAUCUUACAACUGUU-3’;siRNA-3 上游引物 5’-ACAGAUUGUAGAUACAACAUUUGCG-3’，下游引物 5’-CAUGGUUCGUAAUACAACUGACUUU-3’;陰性對照:上游引物 5’-GUCCUCGACCUAGUUACGUTT-3’，下游引物5’-UCUAGACACAGUCGGAGAGTT-3’。

2．3 心肌細(xì)胞搏動率和節(jié)律 在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察60 s，分別計數(shù)10個高倍視野有自發(fā)搏動的細(xì)胞個數(shù)，進(jìn)行攝像記錄心肌細(xì)胞自發(fā)搏動頻率。細(xì)胞搏動率(%)=搏動細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。同時觀察心肌細(xì)胞搏動節(jié)律的變化情況。

2．4 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性的測定 將各組經(jīng)不同處理后的細(xì)胞培養(yǎng)液收集起來，取適量利用全自動生化分析儀測定LDH的活性。

2．5 MTT法測定細(xì)胞存活率 取96孔板種植細(xì)胞，密度為1×105cells/well，空白孔加不含細(xì)胞的培養(yǎng)液(每組4孔)。經(jīng)實驗干預(yù)后，每孔加入20μL MTT溶液(5 g/L)，避光，繼續(xù)溫育4 h，小心吸棄上清，終止培養(yǎng)，然后加入150μL DMSO，搖床振搖15 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀讀取492 nm處吸光度(absorbance，A)。結(jié)果以細(xì)胞存活率表示。細(xì)胞存活率(%)=處理組A值/對照組A值×100%。

2．6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 轉(zhuǎn)染48 h、缺氧12 h后用胰酶消化收集各組細(xì)胞。按Annexin VFITC試劑盒提供的操作說明，主要步驟為:用胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，分別加入 Annexin V-FITC及PI各5μL混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min后，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

2．7 Western blotting檢測各蛋白表達(dá)水平 取各組心肌細(xì)胞，根據(jù)總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，用全自動生化分析儀(Beckman)測定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)蛋白濃度取適量進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后，將膜置于5%脫脂奶粉的TBST中搖床上封閉2 h，用TBST洗膜10 min，共 3 次，分別用 Bim、Bax、Bcl-2、p-p38 MAPK、p38 MAPK和β-actin的I抗按適當(dāng)比例4℃孵育過夜，再洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗兔IgG孵育2 h，最后洗膜3×10 min，進(jìn)行顯色，膠片曝光，結(jié)果用LabWorks 3．0軟件，以目的條帶/β-actin的灰度值進(jìn)行分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行軟件分析，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 原代心肌細(xì)胞的成功培養(yǎng)及鑒定

于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈放射狀、不規(guī)則三角形或梭形，并伸出偽足相互接觸交織成網(wǎng)，呈片狀有節(jié)律搏動。免疫組化結(jié)果顯示，抗體陽性的心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕色顆粒，見圖1。

Figure 1．Identification of the cardiomyocytes(×200)．A:inverted microscopy;B:immunohistochemical staining forα-actin of striated muscle．圖1 心肌細(xì)胞的鑒定

2 篩選有效bim-siRNA

與陰性對照siRNA組比較，3對bim-siRNA均能顯著降低Bim蛋白的表達(dá)，其中以第2對沉默效率最高(P ＜0．01)，其沉默效率達(dá)86．73%，見圖 2。

Figure 2．The effects of siRNAs on expression of Bim．A:hypoxia group;B:hypoxia+liposome group;C:hypoxia+negative control siRNA group;D:hypoxia+siRNA-1 group;E:hypoxia+siRNA-2 group;F:hypoxia+siRNA-3 group．Mean ± SD．n=6．##P ＜0．01 vs hypoxia+negative control siRNA group．圖2 bim-siRNA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞對Bim表達(dá)的影響

3 轉(zhuǎn)染bim-siRNA和缺氧對心肌細(xì)胞搏動頻率和節(jié)律的影響

空白對照組心肌細(xì)胞搏動頻率為150 beats/min左右，搏動呈同步性，收縮明顯而有力，節(jié)律規(guī)則;缺氧刺激后心肌細(xì)胞搏動頻率顯著減慢(P＜0．01)，搏動幅度減小，節(jié)律不規(guī)則;而轉(zhuǎn)染bim-siRNA能抑制缺氧導(dǎo)致的這一作用(P＜0．05或 P＜0．01)，見表1。

4 轉(zhuǎn)染bim-siRNA和缺氧對心肌細(xì)胞LDH釋放、細(xì)胞存活率及凋亡率的影響

與空白對照組比較，缺氧組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯增高(P＜0．01)，細(xì)胞存活率明顯降低(P ＜0．05)，細(xì)胞凋亡率明顯增高(P ＜0．01);而進(jìn)行bim-siRNA轉(zhuǎn)染后，心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH較缺氧+陰性對照siRNA組明顯下降(P＜0．01)，細(xì)胞存活率明顯增加(P＜0．05)，細(xì)胞凋亡率明顯下降(P＜0．01)，而陰性對照siRNA組則與缺氧組無明顯差異，見表2、圖3。這說明通過 RNA干擾下調(diào)Bim表達(dá)能抑制缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。

表1 轉(zhuǎn)染bim-siRNA和缺氧對心肌細(xì)胞搏動頻率和節(jié)律的影響Table 1．The changes of frequency and rhythm of cardiomyocyte beating after bim-siRNA transfection and hypoxia(beats/min．Mean ±SD．n=8)

表2 轉(zhuǎn)染bim-RNA和缺氧對心肌細(xì)胞LDH釋放、細(xì)胞存活率及細(xì)胞凋亡率的影響Table 2．The changes of LDH release，survival rate and apoptotic rate of cardiomyocytes treated with Bim-siRNA transfection and hypoxia(Mean±SD．n=8)

Figure 3．The changes of apoptotic rate of cardiomyocytes treated with bim-siRNA transfection and hypoxia．A:blank control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+liposome group;D:hypoxia+negative control siRNA group;E:hypoxia+bim-siRNA group．圖3 轉(zhuǎn)染bim-siRNA和缺氧對心肌細(xì)胞凋亡率的影響

5 Western blotting檢測心肌細(xì)胞 Bax、Bcl-2、pp38 MAPK和p38 MAPK蛋白表達(dá)水平

Western blotting結(jié)果顯示，與空白對照組比較，缺氧干預(yù)后，心肌細(xì)胞內(nèi)p-p38 MAPK和Bax的表達(dá)明顯增加(P ＜0．05)，Bcl-2表達(dá)下降(P ＜0．01);而通過bim-siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)Bim表達(dá)后，能抑制缺氧導(dǎo)致的這一作用(P＜0．05)，而p38 MAPK表達(dá)無明顯變化。缺氧組與缺氧+陰性對照siRNA組、缺氧+脂質(zhì)體組之間相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖4。

討 論

Bim是Bcl-2家族中僅含BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，是一種重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白。它廣泛分布于機(jī)體各種組織，與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的功能密切相關(guān)，具有促凋亡活性。在正常細(xì)胞中，Bim與細(xì)胞漿中的微管蛋白相結(jié)合，形成復(fù)合體，此時的Bim是無活性的，當(dāng)受到凋亡信號刺激后，Bim就會從復(fù)合體上解離出來游離在細(xì)胞漿中，激活 caspase酶聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。有研究表明，Bim在三氧化二砷誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡的過程中發(fā)揮重要作用，它是調(diào)控三氧化二砷誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞化療敏感和耐藥的主要機(jī)制［5］。Bim可直接促進(jìn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞惡性腫瘤的凋亡［6］。而關(guān)于Bim在缺血缺氧刺激下對心肌細(xì)胞凋亡的作用報道甚少，沉默bim的表達(dá)對缺氧致心肌細(xì)胞凋亡的影響目前尚未見報道。因此，本實驗利用原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞制備缺氧損傷模型，模擬臨床上心肌缺血缺氧損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，用小干擾RNA沉默bim的表達(dá)，觀察心肌細(xì)胞凋亡的變化情況。結(jié)果顯示，缺氧損傷可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡，降低其存活率，增加p-p38 MAPK和Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá);而下調(diào)Bim的表達(dá)能抑制缺氧損傷導(dǎo)致的上述作用。

越來越多的研究表明，心血管疾病的發(fā)生發(fā)展是基于細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)之上的［7-8］。多種刺激均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，如缺氧、缺血再灌注、氧化應(yīng)激及腫瘤壞死因子α［9-11］。在本實驗研究中我們可以得出，心肌細(xì)胞缺氧損傷后，細(xì)胞的存活率下降、LDH釋放量增加、凋亡率明顯升高，而下調(diào)Bim的表達(dá)能夠降低缺氧對心肌細(xì)胞的損傷作用、提高心肌細(xì)胞的存活率，減少LDH的釋放。說明下調(diào)Bim的表達(dá)對缺血缺氧造成的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，這也為心肌缺血缺氧性疾病的治療提供一種可能途徑。

Figure 4．The changes of Bax，Bcl-2，p-p38 MAPK and p38 MAPK protein levels in cardiomyocytes treated with bim-siRNA transfection and hypoxia．A:blank control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+liposome group;D:hypoxia+negative control siRNA group;E:hypoxia+bim-siRNA group．Mean ± SD．n=8．*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01 vs blank control group;#P ＜ 0.05 vs hypoxia+negative control siRNA group．圖4 轉(zhuǎn)染bim-siRNA和缺氧處理后心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2、pp38 MAPK和p38 MAPK蛋白表達(dá)水平的變化

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族在細(xì)胞生物學(xué)活動中發(fā)揮重要作用，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、增殖、分化和凋亡［12］。p38是MAPK家族中一個重要的細(xì)胞內(nèi)信號通路，有研究報道，氧化應(yīng)激、缺血再灌注損傷等通過下調(diào)p38表達(dá)，進(jìn)而減少或抑制心肌細(xì)胞的凋亡［13-14］。研究表明，絲裂原活化蛋白激酶在心臟疾病的誘導(dǎo)和應(yīng)激刺激下，參與肥大、重塑、收縮和心臟衰竭等過程，通過抑制 p38 MAPK信號通路，Dusp1/4基因才能發(fā)揮心臟保護(hù)作用［15］。Bim誘導(dǎo)缺血缺氧的心肌細(xì)胞凋亡，涉及復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，至今尚未闡明。文獻(xiàn)報道，Bim誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡受PI3K/Akt、JNK等多種途徑的影響［16-17］。也有文獻(xiàn)報道，p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了Bim誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程［18］。在本實驗中我們觀察缺氧后以及沉默bim表達(dá)后心肌細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:缺氧損傷使磷酸化的p38 MAPK水平升高，細(xì)胞凋亡率增加，說明缺氧損傷激活了p38 MAPK信號通路。Bim表達(dá)下調(diào)能夠抑制缺氧導(dǎo)致磷酸化的p38 MAPK蛋白表達(dá)升高的作用，進(jìn)一步證明下調(diào)bim的表達(dá)可抑制缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡的作用，同時也說明Bim可能通過p38 MAPK途徑介導(dǎo)缺氧致心肌細(xì)胞損傷。bax是促凋亡基因，bcl-2是抑制凋亡基因。Bax蛋白表達(dá)下降、Bcl-2蛋白表達(dá)升高表明細(xì)胞凋亡被抑制。本實驗結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞予缺氧處理后，促凋亡蛋白Bim水平升高，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下降，而沉默bim的表達(dá)可抑制缺氧導(dǎo)致的上述作用，再次證明下調(diào)Bim的表達(dá)能抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，下調(diào)Bim的表達(dá)能抑制缺氧所致的心肌細(xì)胞存活率下降、凋亡率增加，進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制p38 MAPK、Bax水平及增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。這為冠心病的臨床治療提供一個新思路。