丁 嵐， 田 英， 林國平， 陳志軍， 張彩平， 王小鷗， 陳 浩， 龍石銀△

(南華大學1生物化學與分子生物學教研室，2附屬第一醫(yī)院，湖南衡陽421001)

研究證實高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein，HDL)具有抗動脈粥樣硬化 (atherosclerosis，AS)的作用。HDL顆粒組成極不均一，利用雙向電泳－免疫印跡法可將其分為preβ1-HDL、preβ2-HDL、HDL3c、HDL3b、HDL3a、HDL2a和 HDL2b7 個亞類［1］。HDL亞類組成及含量變化可能是導致心血管疾病發(fā)生的重要原因之一［2］。卵磷脂膽固醇?；D移酶(lecithin cholesterol acyltransferase，LCAT)是人體血漿蛋白代謝的關鍵酶，對HDL的代謝具有十分重要的作用。當LCAT功能受損時，HDL成熟代謝受阻，AS發(fā)生率將增加［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CHD患者血漿HDL亞類有變小的趨勢［4］，但機制未明。CHD患者LCAT水平與其血漿HDL亞類組成之間的關系尚未見報道。本研究通過分析CHD患者血漿HDL亞類組成與載脂蛋白、LCAT的關系，為進一步闡明CHD的發(fā)病機制及預示CHD的危險程度。

材料和方法

1 研究對象一般資料

選取在南華大學附屬醫(yī)院心內科行冠狀動脈造影陽性，并根據(jù)1979年WHO的標準診斷為冠心病的患者144例 (男85例，女59例)，包括缺血性心肌病48例，急性冠脈綜合征39例，心絞痛57例。對照組73例(男45例，女28例)為南華大學附屬醫(yī)院門診健康體檢的人群，經(jīng)病史詢問無冠心病、體格檢查無陽性體征，排除了患有心、肺、肝、腎、內分泌及與脂代謝相關的疾病的人群。2組受試者之間年齡、性別比、既往病史及吸煙、飲酒情況無統(tǒng)計學意義。

2 血漿樣品

受試者空腹12～14 h，取血，分離血漿，并將血漿樣品分為2份，1份用于血脂及載脂蛋白含量的測定，另1份－80℃凍存，用于HDL亞類的檢測。

3 血脂及載脂蛋白含量的測定

血漿甘油三酯 (triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇 (highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇 (low-density lipoprotein cholesterol，LDLC)、載脂蛋白 (apolipoprotein，apo)A-I和 apoB-100含量均由南華附屬醫(yī)院采用全自動生化分析儀 (O-lympus AU400)進行測定。LCAT血漿濃度采用酶聯(lián)免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定，試劑為武漢華美生物工程有限公司提供。

4 HDL亞類免疫印跡試驗

用人血清HDL亞類免疫印跡檢測法［1］進行測定，將樣品中apoA-I的含量和所測得的HDL各亞類的相對百分含量相乘計算各亞類的含量(mg/L)。

5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩個變量間的相關關系用直線相關分析，多元線性回歸分析選入標準定為α=0．05，回歸方程的顯著性檢驗采用方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 冠心病患者血漿HDL亞類含量

由圖1可見，與正常受試者比較，冠心病患者小顆粒的 preβ1-HDL、HDL3b和 HDL3c斑點印跡顯著增大，而大顆粒的HDL2a、HDL2b斑點印跡顯著變小。

Figure 1．Electrophoretic comparisons of apoA-I-containing HDL subclasses．HDL subclasses were separated by nondenaturing 2-dimensional gel electrophoresis and immunodetection with a rabbit antihuman apoA-I-IgG labeled with horseradish peroxidase．A:CHD patients;B:normal subjects．圖1 正常受試者與冠心病患者血漿HDL亞類雙向電泳-免疫印跡實驗結果對比

2 不同LCAT水平冠心病患者血脂及載脂蛋白含量的變化

冠心病患者按血漿LCAT濃度進行四分位數(shù)(19.22、36．39 和 55．32 mg/L)分層:Q1:LCAT ＜19.22mg/L;Q2:19．22≤LCAT ＜ 36．39mg/L;Q3:36．39≤LCAT ＜55．32mg/L;Q4:LCAT≥55．32mg/L。

隨著LCAT濃度的降低，冠心病患者血漿TC、TG水平、apoB-100/A-I比值呈增加趨勢，與最高四分位數(shù)組(Q4)相比，第二四分位數(shù)組(Q2)和最低四分位數(shù)組(Q1)TC、TG水平、apoB-100/A1比值均顯著增加 (P＜0．05或 P＜0．01);與此相反，血漿HDL-C和apoA-I水平呈減少趨勢，與最高四分位數(shù)組(Q4)相比，第三四分位數(shù)組(Q3)、第二四分位數(shù)組(Q2)和最低四分位數(shù)組(Q1)中HDL-C和apoA-I水平顯著降低(P＜0．05或P＜0．01)。與對照組相比，CHD患者(總計)和LCAT各亞組血漿 TC、TG、LDL-C、apoB-100水平和 apoB-100/A-I比值顯著增高，HDL-C和apoA-I水平顯著降低 (P＜0．05或 P＜0．01)。以上結果提示冠心病患者血漿LCAT濃度降低與脂質代謝紊亂關系密切。

表1 冠心病患者按LCAT水平分層的血脂及載脂蛋白含量Table1．PlasmalevelsoflipidsandapolipoproteinsaccordingtoLCATlevelinCHDsubjects(Mean±SD)

3 不同LCAT水平冠心病患者血漿HDL亞類含量的變化

與最高四分位數(shù)組(Q4)相比，第三四分位數(shù)組(Q3)、第二四分位數(shù)組(Q2)和最低四分位數(shù)組(Q1)中 preβ1-HDL 含量增加，HDL2a和 HDL2b含量減少(P＜0．05或 P ＜0．01)，見表2。提示隨著 LCAT濃度的降低，HDL顆粒大小有變小趨勢，HDL成熟代謝受阻。與對照組相比，CHD患者(總計)和不同LCAT各組血漿小顆粒的preβ1-HDL、HDL3c和HDL3b水平顯著增加，而大顆粒的HDL2a和HDL2b水平顯著減少(P＜0．01)，表明CHD患者血漿HDL顆粒具有明顯變小的趨勢。

表2 冠心病患者按LCAT水平分層的血漿HDL亞類含量Table2．PlasmalevelsofplasmaHDLsubclassesaccordingtoLCATlevelinCHDsubjects(Mean±SD)

4 正常TC和高TC的冠心病患者血脂及載脂蛋白含量的變化

冠心病患者按血漿TC濃度進行分組:正常TC組≤5．17mmol/L，高 TC 組 ＞5．17mmol/L。與正常TC組相比，高 TC組的 TC、TG、LDL-C、apoB-100含量和apoB-100/A-I比值顯著升高，HDL-C和apoA-I和LCAT含量顯著降低 (P＜0．05或P＜0．01)，見表3。

表3 正常TC和高TC的冠心病患者血脂及載脂蛋白含量的變化Table 3．Plasma levels of lipids and apolipoproteins between normal TCand high TCgroups in CHD subjects(Mean±SD)

5 正常TC和高TC的冠心病患者血漿HDL亞類含量的變化

與正常TC組相比，高TC組preβ1－HDL含量顯著增加，HDL2a和 HDL2b含量顯著減少 (P＜0.01)，見圖2。

6 冠心病患者血漿HDL亞類與血脂及其它參數(shù)的相關性分析

在控制性別、年齡下，相關性分析發(fā)現(xiàn)，LCAT和HDL-C含量與小顆粒的preβ1-HDL呈顯著負相關(相關系數(shù)r值分別為 －0．446和 －0．317，P ＜0.01)，而與大顆粒HDL2a和HDL2b呈顯著正相關(相關系數(shù) r值分別為 0．512 和 0．519，0．248 和0.168，P＜0.05或 P＜0.01)。TC和 TG含量與preβ1－HDL呈正相關 (相關系數(shù)r值分別為0.388和0.242，P＜0.01)，TG含量與 HDL2b呈顯著負相關 (r= －0.198，P＜0.05)。LDL-C含量與HDL3b呈正相關(r=0.168，P ＜0.05)，apoB-100含量與HDL2b呈負相關(r= －0.190，P ＜0.05)。ApoA-I含量與 HDL各亞類呈正相關，apoB-100/A-I比值與HDL各亞類呈負相關(均P＜0.01)，見表4。

Figure 2．The concentrations of plasma HDL subclasses between normal TCand high TCgroups in CHD subjects．Mean±SD．＊＊P ＜0．01 vs normal TC group．圖2 正常TC和高TC的冠心病患者血漿HDL亞類含量

表4 冠心病患者血漿HDL亞類與血脂等參數(shù)的相關性分析Table 4．Correlation coefficients between the levles of plasma HDL subclasses and biochemical parameters in CHD subjects

7 冠心病患者血漿HDL亞類與血脂和載脂蛋白的多元線性回歸分析

將HDL 7個亞類分別定義為因變量 (Y)，TC、TG、HDL-C、LDL-C、apoA-I、apoB-100 和 LCAT 定義為自變量(X)，進行多元線性回歸分析。7個回歸方程的顯著性檢驗P值均小于0．01，線性關系顯著。ApoA-I與7個 HDL亞類均呈顯著正相關(P＜0.01)，TC 與preβ1-HDL呈顯著正相關 (P ＜0．01)。LCAT 與 preβ1-HDL、HDL3c和 HDL3a呈顯著負相關(P ＜0．05 或 P ＜0．01)，與 HDL2a和 HDL2b呈顯著正相關(P＜0．01)，見表5。結合直線相關和多元線性回歸分析表明，LCAT對血漿HDL亞類含量改變有較大的影響。

表5 冠心病患者血漿HDL亞類與血脂等參數(shù)的多元線性回歸分析Table 5．Multiple linear regression analysis among the levels of plasma HDL subclasses and biochemical parameters in CHD subjects

討 論

CHD是當今世界成人發(fā)病和死亡的主要原因，其死亡率在各種疾病中占首位［5］。HDL被認為是一種抗AS的血漿脂蛋白，可通過多種途徑發(fā)揮抗AS的作用，其中最主要的作用是通過膽固醇的逆向轉運［6-7］。近年一些研究表明HDL亞類分布異常可能直接影響 AS的發(fā)生、發(fā)展［8］。

CHD患者血漿HDL亞類含量結果顯示，CHD患者小顆粒的 preβ1-HDL、HDL3c和 HDL3b濃度顯著增加，而大顆粒的HDL2a和HDL2b濃度顯著減少，提示CHD患者HDL顆粒有變小趨勢，HDL成熟代謝過程可能受阻。此結果與已報道的2型糖尿病患者［9］、腦卒中患者［10］、Ⅳ型高脂血癥患者［11］和肥胖患者［12］血清HDL亞類的變化趨勢基本一致。這樣的變化可能與血漿中調節(jié)脂質代謝的酶有關。本文對LCAT濃度分析中發(fā)現(xiàn)，冠心病患者LCAT濃度明顯低于對照組，且與 preβ1-HDL含量呈負相關，與HDL2a、HDL2b含量呈正相關 (P ＜0．01)。LCAT 主要是催化HDL的游離膽固醇酯化從而使HDL經(jīng)preβ1-HDL→HDL3→HDL2的過程逐漸成熟，apoA-I是LCAT的激活劑，研究中發(fā)現(xiàn)apoA-I水平減少，會使得LCAT的活性降低，HDL的成熟受到影響，出現(xiàn)小顆粒的 preβ1-HDL增多而大顆粒的 HDL2a和HDL2b減小的現(xiàn)象［13］。

將CHD患者按照LCAT水平四分位數(shù)分組后結果顯示，隨著LCAT水平降低，preβ1-HDL含量逐漸升高，HDL2a和HDL2b含量逐漸降低;apoA-I含量也隨LCAT水平降低顯著減少，其含量顯著低于對照組。當apoA-I水平減少，LCAT在血漿中與apoA-I結合能力降低，催化HDL的游離膽固醇轉變成膽固醇酯，小顆粒的HDL3轉化為大顆粒的HDL2過程受阻。Sethi等［14］研究發(fā)現(xiàn)缺血性冠心病患者 LCAT與preβ1-HDL水平有顯著負相關，并認為preβ1-HDL血漿濃度增加和LCAT活性降低是缺血性心臟病的一個很強的獨立于HDL-C的正相關危險標志。大量研究發(fā)現(xiàn)LCAT水平與HDL-C呈正相關，與TG呈負相關，并認為LCAT活性和濃度的改變都將影響HDL 的成熟代謝過程［15］。

對于正常TC和高TC的CHD患者，其HDL亞類的分布特點均是小顆粒HDL亞類明顯增多，而大顆粒HDL亞類明顯減少，表明preβ1-HDL→HDL3→HDL2的成熟代謝過程受阻，這就必將造成HDL膽固醇逆向轉運作用的減弱，血管內皮細胞過剩膽固醇堆積，加速泡沫細胞的形成，最終導致AS性心血管疾病的發(fā)病風險增大。高TC與正常TC受試者比較，preβ1-HDL 含量顯著增加，HDL2a和 HDL2b含量顯著減少，且LCAT濃度也明顯減少。這表明血漿TC的升高和LCAT的降低共同加重HDL亞類成熟代謝障礙。

對冠心病來說，低水平的HDL-C是一個重要的危險因素，近年來把通過改變LCAT活性和濃度，而升高HDL-C作為減少CHD的重要途徑之一。Chen等［16］用小分子化合物激活小鼠和倉鼠血漿中LCAT活性，發(fā)現(xiàn)給藥組與對照組相比，血漿HDL-C和apoA-I濃度，HDL顆粒大小，膽固醇酯/游離膽固醇明顯增加，而VLDL和HDL中TG有減少的趨勢。并認為通過藥物調節(jié)LCAT活性或水平，可以治療血脂異常和減少動脈粥樣硬化的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著LCAT水平的降低，CHD患者血漿HDL顆粒變小的趨勢更加明顯;線性相關與多元回歸分析結果提示:CHD患者HDL亞類代謝異常，不僅與較低水平的血漿LCAT有關，也與血脂改變有關，從而共同導致CHD的發(fā)生發(fā)展。因此對CHD患者的防治措施要從血脂、LCAT等多角度進行，改善或促進膽固醇逆向轉運過程，調整血漿HDL亞類的組成。