張 英，周漢林，劉國道，王 堅

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶草業(yè)與畜牧研究所，海南 儋州 571737; 3.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 儋州 571737)

綠汁發(fā)酵液與纖維素酶對王草青貯品質(zhì)的影響

張 英1,2,3，周漢林1,2，劉國道1,2，王 堅3

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶草業(yè)與畜牧研究所，海南 儋州 571737; 3.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海南 儋州 571737)

本研究探討了綠汁發(fā)酵液與纖維素酶對王草(Pennisetumpurpureum×P.americanum)青貯品質(zhì)的影響。試驗設(shè)對照組(CK)、綠汁發(fā)酵液處理組(PFJ)、纖維素酶處理組(CEL)和綠汁發(fā)酵液+纖維素酶混合處理組(PC)，分別貯藏1、2、3、5、7、14和30 d后開罐，分析其pH值、揮發(fā)性脂肪酸、氨態(tài)氮和可溶性碳水化合物等成分的含量。結(jié)果表明，各處理對王草青貯后的干物質(zhì)含量無明顯影響；pH值均在第1天內(nèi)快速下降，第5天時達(dá)到最小值，且在整個青貯過程中各添加組的pH 值均顯著低于對照組(Plt;0.05)；添加組的乳酸含量在第1天時快速升高，隨發(fā)酵時間的延長，乳酸、乙酸、丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的含量以及AN/TN值都在升高，PFJ與CK組中丁酸含量的變化趨勢相反，而PC組在整個青貯過程均未檢測到丙酸與丁酸；PC組還兼具PFJ 組提高粗蛋白含量與CEL 組降低中性洗滌纖維含量增加可溶性碳水化合物含量的優(yōu)勢。綜合考慮，混合添加綠汁發(fā)酵液與纖維素酶對王草青貯發(fā)酵品質(zhì)的改善效果最好。

王草；青貯品質(zhì)；綠汁發(fā)酵液；纖維素酶

王草(Pennisetumpurpureum×P.americanum)是由象草(P.purpureum)與美洲狼尾草(P.americanum)雜交的多年生禾本科狼尾草屬牧草。王草因具有生長迅速、產(chǎn)量高、適口性好等特點(diǎn)而被廣泛種植于熱帶亞熱帶地區(qū)，目前已經(jīng)在我國海南、廣東、廣西、江西、云南、四川、福建等地推廣種植[1]。2000年底，王草推廣面積超過5萬hm2[2]。王草主要用于刈割青飼或調(diào)制青貯飼料，由于王草雨季生長迅速而旱季、冬春季停止生長，造成家畜青飼料供求不平衡，缺乏青飼料時需要更多成本購買精飼料維持家畜生長，而雨季生長過剩的王草經(jīng)青貯發(fā)酵后恰好可以彌補(bǔ)這一不足。

綠汁發(fā)酵液(Previosly Fermented Juice，PFJ)是一種與乳酸菌類似的青貯添加劑。PFJ具有制作工藝流程簡單、生產(chǎn)成本低、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，較乳酸菌制劑而言，PFJ中存在適合于青貯原料發(fā)酵所需的各種乳酸菌菌種，添加PFJ后青貯效果較好[3]。目前已有較多關(guān)于添加纖維素酶(Cellulose enzyme，CEL)改善青貯發(fā)酵品質(zhì)的報道[4-5]。孫娟娟等[6]指出添加纖維素酶可降解纖維組分生成乳酸菌發(fā)酵底物可溶性碳水化合物(Water Soluble Carbohydrates，WSC)。通過混合添加乳酸菌制劑與纖維素酶在乳酸菌大量繁殖的同時又有充足的發(fā)酵底物供給，可進(jìn)一步提高青貯料的發(fā)酵品質(zhì)[7]。本研究通過添加PFJ與CEL分析其對王草青貯發(fā)酵品質(zhì)動態(tài)變化的影響，以期為提高王草青貯發(fā)酵品質(zhì)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1青貯原料 以熱研4號王草(P.purpureum×P.americanumcv.Reyan No.4)為供試材料，于2012年6月13日采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所畜牧研究中心十隊實(shí)驗田。王草干物質(zhì)含量20.78%，水溶性碳水化合物含量7.56%，粗蛋白含量7.65%。

1.1.2添加劑 綠汁發(fā)酵液(天然乳酸菌接種劑，含有適合發(fā)酵的各種乳酸菌種以及部分大腸桿菌)：稱取150 g王草切碎后加入300 mL蒸餾水打漿，用四層沙布過濾，量取250 mL濾液加入5 g葡萄糖搖勻[8-9]，密封保存于聚乙烯瓶中，于30 ℃下恒溫發(fā)酵48 h[10]，即得王草綠汁發(fā)酵液。

纖維素酶：酶活力≥15 000 U·g-1，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1青貯原料的制作 王草自刈割第2茬起生長57 d后刈割，將刈割好的王草用自動切草機(jī)切碎至1～2 cm，用四分法取樣后分別設(shè)不同的處理組，包括對照組(CK)和添加組(PFJ、CEL、PC)，各處理組添加成分如表1所示。隨后混勻稱取210 g快速裝罐至300 mL實(shí)驗室青貯窖(聚乙烯瓶)中，壓實(shí)加蓋并用黑膠帶密封，分別在室溫保存1、2、3、5、7、14和30 d后開罐取樣，即為王草青貯樣。每處理設(shè)3個重復(fù)，即3罐，共計84個青貯發(fā)酵罐。

表1 不同處理添加水平Table 1 Levels of the experimental additives

注：CK、PFJ、CEL和PC分別為對照組、綠汁發(fā)酵液處理組、纖維素酶處理組和綠汁發(fā)酵液+纖維素酶混合處理組。下同。

Note:CK，PFJ，CEL and PC are coutrol,treatment of previosly fermented juice,treatment of cellulase and treatment of previosly fermented+cellulase，respectively.The same below.

1.2.2樣品處理 青貯罐打開后去除上層霉變的王草，將青貯料全部取出，充分混勻。準(zhǔn)確稱取20 g王草青貯樣于三角瓶中，加入180 mL蒸餾水，攪拌均勻，于4 ℃下浸提24 h后用4層紗布過濾，濾液用定量濾紙過濾兩次，所得浸提液保存于-20 ℃冰箱中備用。余下全部青貯料在65 ℃烘箱中干燥48 h，用于測定干物質(zhì)(DM)含量[11]，烘干后的青貯料用粉樣機(jī)粉碎，過1 mm篩，草粉樣密封保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3青貯飼料分析項目與測定方法 將青貯飼料于65 ℃烘箱中干燥48 h直到質(zhì)量恒定，于干燥器中冷卻，稱其質(zhì)量得干物質(zhì)含量[12]；可溶性碳水化合物(WSC)采用蒽酮-硫酸比色法測定[13]；中性洗滌纖維(Neutral Detergent Fiber，NDF)與酸性洗滌纖維(Acid Detergent Fiber，ADF)用范氏纖維分析法測定[14]；總氮(Total Nitrogen，TN)采用半微量凱氏定氮法測定[15]；pH值用pH計對青貯料浸提液直接測定;氨態(tài)氮(Ammonia Nitrogen，AN)采用笨酚-次氯酸鈉比色法測定[16]；有機(jī)酸[乳酸(Lactic Acid，LA)、乙酸(Acetic Acid，AA)、丙酸(Propionic Acid，PA)、丁酸(Butyric Acid，BA)]用高效液相色譜法(HPLC)測定，色譜條件為采用COMOSIL5C18-PAD色譜柱(4.6 mm×250 mm)進(jìn)行二元梯度洗脫，流動相A為20 mmol·L-1NaH2PO4(H3PO4調(diào)pH 2.65)，B為甲醇；起始流動相為100% A，維持5 min，到8 min為90% A、10% B，維持14 min，最后在22 min時恢復(fù)起始濃度，平衡柱子，進(jìn)下一個樣，其中流速1 mL·min-1、柱溫30 ℃、檢測波長215 nm、進(jìn)樣體積20 μL。

1.3數(shù)據(jù)分析 用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的計算和處理，用SAS 9.0統(tǒng)計軟件中的方差分析程序?qū)μ幚砗蟮臄?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1王草發(fā)酵過程中pH值、有機(jī)酸以及AN/TN值的動態(tài)變化 所有處理的pH值都有相同的變化趨勢。在發(fā)酵初期的1 d內(nèi)各處理的pH值迅速下降到4.2以下，且隨后幾天也顯著下降(Plt;0.05)，至發(fā)酵第5天,各處理pH值均達(dá)到最小值，并且各添加組pH值均顯著低于CK組。隨發(fā)酵時間的繼續(xù)延長，各處理組的pH值又略有回升，發(fā)酵第14～30天，各處理的pH值差異不顯著，且CK組各個發(fā)酵時間的pH值均高于或顯著高于其它處理組。發(fā)酵結(jié)束后，PFJ組pH值顯著低于其余處理組，CEL與PC組差異不顯著(表2)。

王草青貯動態(tài)過程中，各處理的LA含量也有相似的變化趨勢(表2)。添加組的LA上升幅度均在發(fā)酵開始的1 d內(nèi)達(dá)到最大值，而CK組的LA則在第2天迅速上升(Plt;0.05)，各處理組LA含量隨發(fā)酵時間延長而不斷升高，且添加組LA含量均高于CK組，PC組LA含量最高且顯著高于CK組。與LA不同，AA在發(fā)酵第1天很少生成，整個青貯過程中，PC組AA含量呈上升趨勢，其余各組的AA含量上升到第5天時略有降低，隨后又不斷升高。發(fā)酵到最后，CK組AA含量顯著高于其余處理組，而PC組顯著低于其余處理組。在整個青貯過程中，各處理在各個發(fā)酵時間的LA/AA值均大于1，CK組LA/AA值顯著低于各添加組，發(fā)酵初期PFJ組LA/AA值最高，隨著發(fā)酵進(jìn)行，各組LA/AA值不斷降低，至7 d以后降低幅度減小，30 d時PC組LA/AA值顯著高于其余各處理組。

表2 王草青貯發(fā)酵品質(zhì)Table 2 Fermentation quality of King grass silages

注：同列不同小寫字母表示相同處理不同青貯時間之間差異顯著(Plt;0.05);同行不同大寫字母表示相同的發(fā)酵時間不同的處理間差異顯著(Plt;0.05 )。下同。

Note：Different lower case letters within the same column indicate significant difference among different storage time for the same treatment at 0.05 level;different capital letters within the same row indicate significane difference among different treatments for the same storage time at 0.05 level.The same below.

PA在整個發(fā)酵階段很少產(chǎn)生，其中PC組從發(fā)酵開始到發(fā)酵結(jié)束均未檢測到PA(表3)。PFJ組在發(fā)酵前7 d也未檢測到PA，發(fā)酵第14天以后有少量PA生成。CK組與CEL組的PA變化與pH值相似，都在第5天時到最低，隨后又升高。PC組未檢測到BA，其余各處理組BA含量也較低，其中，CEL組在發(fā)酵7 d后有少量BA生成，而CK組與PFJ組的BA變化趨勢完全相反，CK組BA隨發(fā)酵進(jìn)行不斷升高，而PFJ組BA含量的變化則與之相反?？俈FA含量的變化趨勢與AA相似，均是在發(fā)酵初期含量較低，隨后除個別時間段略有波動外，總體呈上升趨勢，發(fā)酵到最后CK組的總VFA含量顯著高于其余處理組(Plt;0.05)，PC組總VFA含量最低。

表3 王草青貯發(fā)酵品質(zhì)Table 3 Fermentation quality of King grass silages

注： “-”表示未檢測到。

Note：“-” indicates corresponding item did not find in the treatment.

表4 王草青貯飼料的化學(xué)成份Table 4 Chemical composition of King grass silages g·kg-1

CK組與PFJ組的AN/TN值隨青貯時間延長呈升高趨勢，CK組在發(fā)酵結(jié)束時AN/TN值顯著高于各添加組(Plt;0.05)。CEL組與PC組AN/TN值的變化除個別發(fā)酵時間有波動外，總體呈上升趨勢。發(fā)酵末期，PC組與CEL組的AN/TN值顯著低于CK組與PFJ組(表3)。

2.2DM、WSC、CP以及NDF、ADF含量的變化 PFJ組與PC組整個發(fā)酵過程的DM 含量差異不顯著(Plt;0.05)，CK組與CEL組發(fā)酵期間DM 含量有略微波動，經(jīng)30 d青貯發(fā)酵后，各處理間DM 含量差異不顯著(表4)。

3 討論

3.1綠汁發(fā)酵液對王草青貯品質(zhì)的動態(tài)影響 本研究采用實(shí)驗室聚乙烯瓶充當(dāng)小型青貯窖，其密封性較好，幾乎沒有青貯料發(fā)酵液的流失，因此至發(fā)酵結(jié)束各處理的DM 含量變化很小。

綠汁發(fā)酵液是青貯原料經(jīng)發(fā)酵制得的乳酸菌發(fā)酵液，它能較好地適應(yīng)原料的青貯發(fā)酵。王草添加PFJ后，pH值在發(fā)酵初期快速降到4.0以下并在整個發(fā)酵過程中顯著低于對照組。從發(fā)酵第1天起，PFJ組的乳酸含量遠(yuǎn)大于對照組(Plt;0.05)，而揮發(fā)性脂肪酸、氨態(tài)氮的含量則顯著低于對照組(Plt;0.05)，還減少了AN/TN值。在發(fā)酵初期，PFJ組中丁酸含量顯著高于對照組(Plt;0.05)，這可能是由于綠汁發(fā)酵液添加劑在制作過程中產(chǎn)生了少量酪酸菌或丁酸。添加綠汁發(fā)酵液后乳酸菌迅速大量繁殖，同時也抑制了羧酸菌、酪酸菌等有害微生物的活性，降低了蛋白氮的分解。本研究表明，添加綠汁發(fā)酵液改善了王草青貯發(fā)酵品質(zhì)，這也驗證了唐維新[9]對綠汁發(fā)酵液的相關(guān)研究。許慶方[17]研究表明，在苜蓿(Medicagesativa)青貯料中加入PFJ可以降低pH值，減少丁酸與氨態(tài)氮的含量，同時增加乳酸的含量。鄭丹等[18]對雜交狼尾草青貯發(fā)酵品質(zhì)的研究也得出類似的結(jié)論，添加PFJ后在抑制丁酸菌及其他有害微生物活性的同時還促進(jìn)了同質(zhì)乳酸菌的發(fā)酵，提高了雜交狼尾草青貯發(fā)酵的品質(zhì)。添加綠汁發(fā)酵液后，乳酸菌的快速繁殖利用了大量可溶性糖，最終可溶性糖的含量低于對照組，但在青貯發(fā)酵結(jié)束后還有剩余的可溶性糖，表明王草本身有足夠的發(fā)酵底物供其青貯發(fā)酵。在整個青貯過程中，PFJ組的粗蛋白含量都顯著高于CK組(Plt;0.05)，楊亞文等[19]、雷宇杰和黃光玲[20]發(fā)現(xiàn)通過微生物發(fā)酵可提高發(fā)酵原料中的粗蛋白含量，但添加綠汁發(fā)酵液后對酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維的含量幾乎沒影響。

3.2纖維素酶對王草青貯品質(zhì)的動態(tài)影響 有相關(guān)報道指出，纖維素酶在青貯中的利用效果不盡相同。Jacobs和Mcallan[5]發(fā)現(xiàn)，添加纖維素酶到苜蓿中青貯可有效降低青貯料中酸性洗滌纖維與中性洗滌纖維的含量。Selmer-Olsen等[4]指出，加入纖維素酶可降低黑麥草(Loliumperenne)青貯料的pH值及氨態(tài)氮、NDF和ADF含量，增加乳酸含量。但Kung等[21]添加纖維素酶對3個不同生長階段的大麥(Hordeumvulgare)和野豌豆(Viciasepium)進(jìn)行青貯表明，僅pH值有所降低，NDF和ADF含量均沒有改變，對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響不明顯。Sheperd與Kung[22]的研究結(jié)果表明，纖維素酶對玉米(Zeamays)青貯過程中的有機(jī)酸無影響。添加纖維素酶出現(xiàn)不同效果的原因很多，與青貯原料、貯藏溫度、酶的使用水平以及含水率等因素相關(guān)。酶對溫度、濕度、酸堿等條件敏感，在青貯過程中不易操控，易失活，并且各處理的酶活性也難統(tǒng)一，這都可能導(dǎo)致酶處理的青貯效果不同。本研究中添加纖維素酶對王草青貯品質(zhì)的改善效果與綠汁發(fā)酵液幾乎相同，在發(fā)酵初期顯著降低了青貯料的pH值(Plt;0.05)，乳酸菌迅速大量繁殖，降低了揮發(fā)性脂肪酸以及AN/TN值，對粗蛋白與酸性洗滌纖維的含量影響不顯著(Plt;0.05)。但不同的是，在發(fā)酵初期可溶性糖含量顯著高于CK組與PFJ組(Plt;0.05)，還降低了中性洗滌纖維的含量，這可能是由于纖維素酶降解了纖維素并轉(zhuǎn)化成乳酸菌的發(fā)酵底物，Colombatto等[23]也得到類似結(jié)果。這也可能是致使發(fā)酵初期CEL組的乙酸含量顯著高于PFJ組的原因，發(fā)酵初期充分的發(fā)酵底物在大量促進(jìn)乳酸菌生長的同時也促進(jìn)了部分乙酸菌的生長。

3.3混合添加綠汁發(fā)酵液與纖維素酶對王草青貯品質(zhì)的動態(tài)影響 混合添加綠汁發(fā)酵液與纖維素酶后在乳酸菌快速繁殖的同時，纖維素酶又間接為其提供了充足的發(fā)酵底物，這可能是由于乳酸菌與纖維素酶的混合添加產(chǎn)生了疊加效應(yīng)[7]。目前已有許多關(guān)于混合添加酶與乳酸菌制劑能最大改善青貯發(fā)酵品質(zhì)的報道[24-25]。王草中混合添加綠汁發(fā)酵液和纖維素酶后使乳酸含量與LA/AA值高于或顯著高于單獨(dú)添加綠汁發(fā)酵液與纖維素酶的處理組(Plt;0.05)。乳酸菌的迅速繁殖生成大量乳酸抑制了酪酸菌等有害微生物的生成，最終其總揮發(fā)性脂肪酸、AN/TN值在各處理組中最低，整個發(fā)酵過程中未檢測到丙酸和丁酸產(chǎn)生，另外還兼具PFJ組與CEL組的優(yōu)勢，提高了粗蛋白的含量，與CEL組一樣，在發(fā)酵初期有較高可溶性碳水化合物。PC組AA含量顯著高于PFJ組，而PC組AA含量與CEL組差異不顯著，還降低了中性洗滌纖維的含量，但對酸性洗滌纖維無顯著影響。

4 結(jié)論

本研究表明，添加綠汁發(fā)酵液、纖維素酶和綠汁發(fā)酵液+ 纖維素酶3 種處理都可以改善王草青貯發(fā)酵品質(zhì)，均能快速降低青貯料的pH值，使乳酸菌快速繁殖，降低揮發(fā)性脂肪酸、氨態(tài)氮的含量。混合添加的處理還能兼具添加綠汁發(fā)酵液提高粗蛋白含量與添加纖維素酶降低中性洗滌纖維含量增加可溶性碳水化合物含量的優(yōu)勢，因此，綠汁發(fā)酵液與纖維素酶混合處理在改善王草青貯發(fā)酵品質(zhì)上效果最好。

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(1.Tropical Crop Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agriculture Science, Danzhou 571737, China;2.Tropical Grassland and Animal Science Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural sciences, Danzhou 571737,China; 3.College of Agriculture, Hainan University, Danzhou 571737, China)

Liu Guo-dao E-mail:liuguodao@scuta.edu.cn

EffectsofprevioslyfermentedjuiceandcelluloseenzymeonthedynamicfermentationchangesofKinggrasssilages

ZHANG Ying1,2,3, ZHOU Han-lin1,2, LIU Guo-dao1,2，WANG Jian3

This study is to evaluate effects of adding previously fermented juice and cellulose enzyme on the fermentation quality of King grass silages. The experimental treatments were CK(no additive), PFJ(previously fermented juice), CEL(cellulose enzyme)and PC(previosly fermented juice and cellulose enzyme). Silos were opened after seven ensiling periods(1, 2, 3, 5, 7, 14 and 30 days of ensiling)and the fermentation qualities(pH value, VFAS, the contents of ammonia-N and WSC and other chemical composition)were analyzed. All treatments did not influence the DM after ensiling. There was well reflected faster and larger pH decline and lactic acid production during the first day of ensiling and the lowest pH value in the 5th day of ensiling. All additive treatments had a significantly(Plt;0.05)lower pH value than CK. Lactic acid, acetic acid, propionic acid, total volatile fatty acid content and AN/TN value rose gradually, and the change of butyric were contrary in between PFJ and CK. Propionic acid and butyric acid were not found in PC, PC also hold concurrently the advantage of PFJ improved crude protein content and CEL reduced neutral detergent fiber content to increase water soluble carbohydrate content. These results showed that mixing add previosly fermented juice and cellulose enzyme to the silage was the optimum for fermentation quality of King grass.

King grass; silage; previosly fermented juice; cellulose enzyme

Zhou Han-lin E-mail:zhouhanlin8@163.com

S816.6

A

1001-0629(2013)10-1640-08

2013-01-14 接受日期：2013-03-07

中央級公益科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(PZS066)；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院院本級項目(1630032012049)；國家現(xiàn)代牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-35)；農(nóng)業(yè)部熱帶作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)開放實(shí)驗室開放基金“熱帶主要栽培牧草青貯發(fā)酵特性研究(KFKT-2011-10)”作者簡介:張英(1987-)，女，四川威遠(yuǎn)人，碩士，研究方向為熱帶牧草栽培。E-mail:janecy0728@126.com

周漢林(1971-)，男，湖北浠水人，研究員，碩導(dǎo)，主要研究方向為熱帶牧草生產(chǎn)與反芻動物營養(yǎng)。 E-mail:zhouhanlin8@163.com劉國道(1963-)，男，云南騰沖人，研究員，博士,主要從事熱帶牧草種質(zhì)資源研究。E-mail:liuguodao@scuta.edu.cn