樸麗花，蔡英蘭，張默函，姜京植，金政#，許祖德（.延邊大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，吉林延吉33000；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院病理科，上海 200040）

人參皂苷Rh2（Gensenoside Rh2）是從人參中提取的天然活性成分，分子式為C36H62O8H2O，分子質(zhì)量622，化學(xué)名為20（S）-人參二醇-3-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷，以往研究已經(jīng)證實(shí)了它能在多個(gè)環(huán)節(jié)上抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等[1-3]。在對(duì)阿霉素（ADM）的前期試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2能顯著增強(qiáng)人乳腺癌MCF7/Adr細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，提高ADM在細(xì)胞內(nèi)的聚積，同時(shí)人參皂苷Rh2也能明顯抑制ADM對(duì)細(xì)胞P-糖蛋白（P-gp）水平的上調(diào)，從而證實(shí)人參皂苷Rh2確實(shí)具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用[4]。近年來(lái)研究顯示，磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信號(hào)通路參與并促進(jìn)了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。聯(lián)合治療已成為當(dāng)今抗腫瘤研究的重要手段[5-6]，兩種藥物協(xié)同作用有助于放大較弱的細(xì)胞信號(hào)。因此，本研究中筆者用PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002聯(lián)合人參皂苷Rh2處理MCF7/Adr細(xì)胞，以觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響。

1 材料

1.1 儀器

PROTEAN3型垂直式電泳儀、SD型半干轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；Avanti30型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；Vmax型酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Device公司）；TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rh2（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度：＞98%）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Invitrogen公司）；MTT、鼠抗β-actin單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司）；基底膜、Transwell室（美國(guó)BD公司）；LY294002（美國(guó)Alexis Biochemicals公司）；兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2多抗、AKT、磷酸化絲蘇氨酸蛋白激酶（p-AKT）單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；鼠抗P-gp單克隆抗體（德國(guó)Calbiochem公司）；二抗羊抗兔、羊抗鼠（美國(guó)Rockland公司）。

1.3 細(xì)胞株

人乳腺癌MCF7/Adr細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF7/Adr細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d更換培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化傳代。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF7/Adr細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為四組，即對(duì)照（空白培養(yǎng)液）組、人參皂苷Rh2（80 μmol/L）組、LY294002（50 μmol/L）組、人參皂苷Rh2（80 μmol/L）+LY294002（50 μmol/L）組。

2.2 Western blot檢測(cè)[7]

當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至30%～40%時(shí)，MCF7/Adr細(xì)胞的培養(yǎng)液加入不同藥物作用24 h后，細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，定量后取等量樣本行SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜在封閉液中封閉2 h，分別與P-gp、MMP-2、AKT、p-AKT、β-actin的一抗置4℃孵育過(guò)夜。洗膜后再與二抗室溫孵育1 h；TBST室溫洗膜5 min×3次；將膜轉(zhuǎn)入新鮮配制的化學(xué)發(fā)光（ECL）孵育液中，室溫孵育5 min；轉(zhuǎn)入X光暗盒中曝光3 min，顯影，定影。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞黏附人工重組基底膜試驗(yàn)

96孔培養(yǎng)板每孔預(yù)鋪基底膜10 μg/50 μl，置超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干；培養(yǎng)板用2%牛血清白蛋白（BSA）封阻，置37℃孵育1 h，PBS沖洗并棄去；收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7/Adr細(xì)胞，終細(xì)胞密度為6×105/ml，每孔加入100 μl，并設(shè)DMEM培養(yǎng)基調(diào)零孔，37℃培養(yǎng)1 h；棄培養(yǎng)液，以PBS液輕輕沖洗3次除去未黏附細(xì)胞；棄去PBS，每孔加入100 μl DMEM 培養(yǎng)基和50 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去MTT，每孔加入150 μl DMSO溶解，搖振15 min，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（OD）。每組平行設(shè)3個(gè)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率（%）＝（1－用藥組黏附細(xì)胞OD均值）/對(duì)照組黏附細(xì)胞OD均值×100%。

2.4 細(xì)胞體外侵襲試驗(yàn)[8]

MCF7/Adr細(xì)胞接種于覆蓋基底膜的Transwell室的上室，用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；48 h后棄培液，用棉簽輕柔拭去膜上細(xì)胞，經(jīng)HE染色后在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。

2.5 細(xì)胞體外遷移試驗(yàn)

除Transwell室底部膜的內(nèi)表面上未鋪基底膜，其余操作同“2.4”項(xiàng)下方法。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Western blot檢測(cè)P-gp、MMP-2、AKT、p-AKT蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組比較，人參皂苷Rh2組、LY294002組、人參皂苷Rh2+LY294002組AKT蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），人參皂苷Rh2組、LY294002 組、人參皂苷Rh2+LY294002組P-gp、MMP-2、p-AKT蛋白表達(dá)顯著減弱（P＜0.05）；與人參皂苷Rh2組、LY294002組比較，人參皂苷Rh2+LY294002組AKT蛋白表達(dá)顯著減弱（P＜0.05）。P-gp、MMP-2、AKT、p-AKT蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖1。

圖1 P-gp、MMP-2、AKT、p-AKT蛋白的表達(dá)1.對(duì)照組；2.人參皂苷 Rh2組；3.LY294002 組；4.人參皂苷 Rh2+LY294002組Fig 1 Expression of P-gp，MMP-2，AKT and p-AKT1.control group；2.gensenoside Rh2group；3.LY294002 group；4.gensenoside Rh2+LY294002 group

3.2 人參皂苷Rh2、LY294002、人參皂苷Rh2+LY294002對(duì)MCF7/Adr細(xì)胞黏附的影響

與對(duì)照組比較，人參皂苷Rh2組、LY294002組、人參皂苷Rh2+LY294002組細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的黏附力能力顯著降低（P＜0.05）。MCF7/Adr細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1（黏附抑制率越高表明其黏附力越?。?。

表1 MCF7/Adr細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Results of tests for cell-ground substance adhesion test of MCF7/Adr cell（s±s，n＝6）

表1 MCF7/Adr細(xì)胞黏附試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Results of tests for cell-ground substance adhesion test of MCF7/Adr cell（s±s，n＝6）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.05vs.control group：＊P＜0.05

組別對(duì)照組人參皂苷Rh2組LY294002組人參皂苷Rh2+LY294002組濃度，μmol/L 黏附抑制率，%17.5＊18.7＊43.7＊805080+50黏附細(xì)胞OD值74.51±3.6561.42±4.46＊60.68±2.37＊42.17±3.82＊

3.3 人參皂苷Rh2、LY294002、人參皂苷Rh2+LY294002對(duì)MCF7/Adr細(xì)胞侵襲的影響

與對(duì)照組比較，人參皂苷Rh2組、LY294002組、LY294002+Rh2組穿過(guò)微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與人參皂苷Rh2組、LY294002組比較，人參皂苷Rh2+LY294002組穿過(guò)微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。MCF7/Adr細(xì)胞侵襲試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2（過(guò)膜細(xì)胞數(shù)越少表明遷移能力越弱）。

3.4 人參皂苷Rh2、LY294002、人參皂苷Rh2+LY294002對(duì)MCF7/Adr細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組比較，人參皂苷Rh2組、LY294002組、人參皂苷Rgh2+LY294002組穿過(guò)未鋪基底膜微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與人參皂苷Rh2組、LY294002組比較，人參皂苷Rgh2+LY294002組穿未鋪基底膜微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。MCF7/Adr細(xì)胞遷移試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2（過(guò)濾細(xì)胞數(shù)越少表明侵襲能力越弱）。

表2 MCF7/Adr細(xì)胞侵襲和遷移試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Results of invasion and metastasis tests of MCF7/Adr cell（s±s，n＝6）

表2 MCF7/Adr細(xì)胞侵襲和遷移試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝6）Tab 2 Results of invasion and metastasis tests of MCF7/Adr cell（s±s，n＝6）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.05；與人參皂苷Rh2組或LY294002組比較：#P＜0.05vs.control group：＊P＜0.05；vs.grensenoside Rh2group or LY 294002 group：#P＜0.05

組別對(duì)照組人參皂苷Rh2組LY294002組人參皂苷Rh2+LY294002組遷移試驗(yàn)65.14±3.3847.31±6.21＊45.47±4.55＊36.21±8.51＊#濃度，μmol/L 805080+50穿膜細(xì)胞數(shù)侵襲試驗(yàn)60.26±5.3644.31±3.65＊34.47±5.46＊27.84±7.24＊#

4 討論

近年來(lái)，乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重威脅著女性的健康，病死率居世界癌癥的第2位[9]?；熓侵委煇盒阅[瘤的傳統(tǒng)方法，但腫瘤的多藥耐藥與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的重要原因之一?？朔[瘤細(xì)胞的耐藥性，抑制轉(zhuǎn)移是目前臨床上亟需解決的問(wèn)題。傳統(tǒng)中草藥提取的單體或有效成分，既保持有其天然溫和的特性，又減輕了毒副作用，具有很大的優(yōu)勢(shì)[10-11]。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的耐藥和轉(zhuǎn)移之間存在一定相關(guān)性[12]，P-gp的高表達(dá)除了與多藥耐藥相關(guān)外，還與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，P-gp表達(dá)的增加，同時(shí)伴有MMP-2表達(dá)的增加。PI3K/AKT介導(dǎo)的信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在多種腫瘤組織及細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路參與調(diào)控P-gp與MMP-2的表達(dá)，從而調(diào)控腫瘤的多藥耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移[13-16]。此外，PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002或Wortmanin則可以抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[17]。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LY294002、Rh2、人參皂苷Rh2+LY294002處理模型MCF7/Adr細(xì)胞后，P-gp、MMP-2、p-AKT 蛋白表達(dá)減弱，人參皂苷Rh2+LY294002組與人參皂苷Rh2組、LY294002組比較上述指標(biāo)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。推測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路可能是通過(guò)調(diào)控P-gp與MMP-2的表達(dá)從而調(diào)節(jié)腫瘤的多藥耐藥和侵襲遷移。在腫瘤的臨床治療中，聯(lián)合應(yīng)用能靶向抑制PI3K/AKT通路的藥物可能會(huì)有效抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

腫瘤細(xì)胞侵襲或遷移過(guò)程中的關(guān)鍵步驟是穿過(guò)基底膜，這個(gè)過(guò)程包括通過(guò)細(xì)胞的表面受體黏附到基底膜上，分泌多種酶降解鄰近的基底膜組織，在化學(xué)趨化物的作用下穿透移動(dòng)到目標(biāo)組織。本研究證實(shí)了人參皂苷Rh2對(duì)MCF7/Adr細(xì)胞的侵襲和遷移有明顯的抑制作用，經(jīng)人參皂苷Rh2和LY294002處理的細(xì)胞黏附力、侵襲力和遷移力明顯降低，進(jìn)而抑制了乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

綜上所述，本研究證明抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可有效降低MCF7/Adr侵襲、遷移能力，PI3K/AKT通路是調(diào)控乳腺癌侵襲、遷移的重要信號(hào)通路之一。

[1]胡碩，余建英，熊玲靜，等.Rh2逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑抗性作用的機(jī)制[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90（7）：264.

[2]吳歌，李紅，楊世杰.人參皂苷單體Rh2抑制小鼠前胃癌系細(xì)胞增殖及其機(jī)制[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24（1）：101.

[3]岳峰，周進(jìn)朝.人參皂苷Rh2對(duì)人食管癌Eca-109細(xì)胞TFPI-2表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21（21）：2304.

[4]樸麗花，金政，蔡英蘭，等.人參皂苷Rh2抗乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2011，27（11）：867.

[5]Arafa el-SA，Zhu Q，Barakat BM，et al.Tangeretin sensitizes cisplatin-resistant human ovarian cancer cells through downregulation of phosphoinositide 3-kinase/Akt signaling pathway[J].Cancer Res，2009，69（23）：8910.

[6]Li Y，Rory Goodwin C，Sang Y，et al.Camptothecin and Fas receptor agonists synergistically induce medulloblastoma cell death：ROS-dependent mechanisms[J].Anticancer Drugs，2009，20（9）：770.

[7]常和平，王思明，霍長(zhǎng)虹，等.木果楝內(nèi)酯化合物抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖活性及作用機(jī)制的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（6）：807.

[8]王燕燕，周政濤，崔向軍，等.蛋白激酶C抑制劑星形孢菌素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞侵襲力的影響研究[J].中國(guó)藥房，2010，21（25）：2336.

[9]張眾，李連宏，Xiao Gray Guishan，等.MicroRNA與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，28（7）：713.

[10]劉曉霞，張永澤，李振紅，等.寶藿苷-Ⅰ對(duì)人食管癌細(xì)胞Eca-109 Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J].中草藥，2011，42（1）：124.

[11]樸麗花，蔡英蘭，張默函，等.人參皂苷Rg3在體外對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2012，28（9）：659.

[12]盧烈盛，宋科瑛，王瑞濤，等.乳腺癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR1 mRNA表達(dá)及與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析[J].腫瘤，2009，29（3）：276.

[13]Yu P，Zhou L，Ke W，et al.Clinical significance of pAKT and CD44v6 Overexpression with breast cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，2010，136（8）：1283.

[14]Liu F，Liu S，He S，et al.Survivin transcription is associated with P-glycoprotein/MDR1 overexpression in the multidrug resistance of MCF-7 breast cancer cells[J].Oncol Rep，2010，23（5）：1469.

[15]Tian T，Nan KJ，Guo H，et al.PTEN inhibits the migration and invasion of HepG2cells by coordinately decreasing MMP expression via the PI3K/Akt pathway[J].Oncol Rep，2010，23（6）：1593.

[16]Urso L，MuscellaA，Calabriso N，et al.Effects of cisplatin on matrix metalloproteinase-2 in transformed thyroid cells[J].Biochem Pharmacol，2010，79（6）：810.

[17]王艷麗，高青.抑制PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲影響的研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，36（1）：27.