李興玉 ，王 強(qiáng) ，林 毅 ，鄧家波 ，廖黨金 *，牛李麗

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；2.成都市動(dòng)物園＆成都野生動(dòng)物研究所，四川 成都 610081）

禽流感病毒廣泛存在于世界范圍內(nèi)的家禽和鳥體內(nèi)，野生水禽被認(rèn)為是禽流感病毒主要的自然儲(chǔ)存宿主。近十年來，已有研究報(bào)道高致病性禽流感可引起野生黑天鵝、斑頭雁、棕頭鷗發(fā)病死亡，并從野生鳥類中分離出高致病性H5N1病毒。新城疫病毒同樣在世界范圍內(nèi)的家禽和多種鳥類身上存在可造成家禽感染發(fā)病死亡，多種野鳥被認(rèn)為是新城疫病毒的自然儲(chǔ)存庫。成都動(dòng)物園目前有百鳥苑、鸚鵡館、水禽湖等，飼養(yǎng)著孔雀、黑天鵝等多種珍禽。動(dòng)物園每年都有一定數(shù)量的初生珍禽孵出，因此做好雛禽禽流感、新城疫等重要疫病的免疫預(yù)防對于珍禽的繁育工作具有重要意義。但是，目前動(dòng)物園尚未建立起一套針對初生珍禽的免疫程序，國內(nèi)外可以借鑒的此類研究非常有限，因此，本項(xiàng)目組采集了初生珍禽的血清用于測定母源抗體，并對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以建立一套適合初生珍禽的免疫程序。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 成都動(dòng)物園圈養(yǎng)的孔雀、綠頭鴨等6種初生珍禽。

1.1.2 試驗(yàn)疫苗 禽流感(H5+H9)二價(jià)滅活疫苗：哈維科生物技術(shù)公司生產(chǎn)；雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)滅活疫苗（LaSota株 +M41株）：齊魯動(dòng)物保健有限公司生產(chǎn)；雞新城疫弱毒活疫苗（LaSota株）：哈維科生物技術(shù)公司生產(chǎn)。

1.1.3 檢測試劑 H5亞型禽流感抗原、陽性血清和H9亞型禽流感抗原、陽性血清，均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原、陽性血清，購自青島易邦生物工程公司。

1.1.4 1%紅細(xì)胞懸液 采集3只無禽流感、新城疫抗體的青年健康公雞血液與等體積的阿氏液混合，用pH值為7.2的0.01mol/L PBS液離心洗滌3次，然后用該P(yáng)BS液配成體積分?jǐn)?shù)為1%的紅細(xì)胞懸液。

1.2 方法

1.2.1 免疫 采用胸部肌肉或皮下注射的方法同時(shí)免疫禽流感（H5+H9）二價(jià)滅活疫苗、新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)滅活疫苗，免疫劑量為0.3～0.5mL/羽；同時(shí)用2頭份/羽的免疫劑量滴鼻免疫雞新城疫弱毒活疫苗（LaSota株）。

1.2.2 血清采集 15日齡以下的初生珍禽在心臟采血，其余珍禽在翅靜脈采血，待血清析出后，8 000 r/min離心4min，吸出血清并編號，－20℃冰箱中保存，備用。

1.2.3 抗體檢測 參照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936-2003)和《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T 16550-2008)標(biāo)準(zhǔn)，采用血凝抑制試驗(yàn)方法檢測血清中的禽流感、新城疫抗體。

1.2.4 結(jié)果判定 以完全抑制4個(gè)血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI效價(jià)，只有陰性對照孔效價(jià)不大于2log2，陽性對照孔誤差不超過1個(gè)log2，試驗(yàn)結(jié)果才有效。

2 結(jié)果與分析

2.1 初生珍禽母源抗體的檢測結(jié)果 在2012年雛禽的出孵季節(jié)，采集了15日齡左右初生珍禽的9份血清進(jìn)行母源抗體測定，檢測結(jié)果見表1。表1顯示6種初生珍禽的禽流感、新城疫母源抗體較好，其中白冠長尾雉、孔雀、白鷴、藍(lán)鷴的母源抗體基本在5log2以上，綠頭鴨的禽流感母源抗體較差，但也在4log2以上，未免疫成年大雁所產(chǎn)的雛雁也檢出了低效價(jià)的母源抗體。

表1 初生珍禽母源抗體測定結(jié)果log2

母源抗體雖然能使幼禽抵御感染獲得被動(dòng)性免疫保護(hù)，但卻可能干擾疫苗（特別是弱毒苗）對雛禽的免疫效果，因此確定雛禽的首免日齡很關(guān)鍵。一般選擇雛禽的母源抗體達(dá)到免疫保護(hù)臨界值時(shí)對雛禽進(jìn)行首免，這樣既可使雛禽獲得母源抗體的保護(hù)，又可減少母源抗體對免疫效果的干擾。分析近年來家禽及孔雀、鴕鳥等雛禽禽流感、新城疫母源抗體的消長規(guī)律，可知雛禽的免疫抗體在10日齡內(nèi)達(dá)高峰以后隨著日齡增加母源抗體逐漸消失。母源抗體的消失時(shí)間與母源抗體的基礎(chǔ)水平呈正相關(guān)，即母源抗體基礎(chǔ)水平越高，則消失時(shí)間越長。不同品種的雛禽，其母源抗體半衰期有差異，但一般為4d左右下降一個(gè)滴度。本次試驗(yàn)參照家禽禽流感、新城疫免疫程序，初步建立了初生珍禽的免疫程序：15日齡首免，首免后1個(gè)月加強(qiáng)免疫1次。

2.2 初生珍禽免疫后對AI、ND抗體的測定 為了檢測上述免疫程序的免疫效果，在加強(qiáng)免疫后1個(gè)月采集了白冠長尾雉等5種初生珍禽的25份血清進(jìn)行了免疫抗體檢測，結(jié)果見表2。

表2 初生珍禽免疫后的抗體檢測結(jié)果

上述初生珍禽的免疫抗體檢測結(jié)果顯示：初生珍禽產(chǎn)生了較好的免疫抗體，白冠長尾雉、孔雀等種珍禽群體在加免后1個(gè)月，禽流感H5、H9亞型的HI抗體幾何平均值分別為7.6log2、7.2log2，免疫合格率分別為100%、84%，白冠長尾雉、孔雀、白鷴3種幼禽的新城疫抗體幾何平均值為7.18log2，免疫合格率達(dá)94.12%。

3 結(jié)論及分析

由于珍禽價(jià)值昂貴，數(shù)量較少，采樣難度大，特別是初生珍禽的采樣難度更大，部分初生珍禽甚至在前期采血過程中即死亡，因此本試驗(yàn)僅檢測了9日齡左右初生珍禽的母源抗體效價(jià)，未能測定初生珍禽母源抗體的消長規(guī)律，而主要參照了家禽及孔雀、鴕鳥等相關(guān)禽類母源抗體的消長規(guī)律，以此來建立初生珍禽的免疫程序。為了檢測該免疫程序的免疫效果，在雛禽加免后1個(gè)月筆者又進(jìn)行了免疫抗體測定，其結(jié)果顯示：所免疫的5種珍禽的禽流感免疫抗體幾何平均值都超過了5log2；免疫的3種珍禽的新城疫免疫抗體幾何平均值超過了6log2，均超過了農(nóng)業(yè)部禽流感、新城疫免疫監(jiān)測方案中“禽流感免疫抗體效價(jià)應(yīng)≥4log2，新城疫免疫抗體效價(jià)應(yīng)≥5log2，免疫合格率≥70%”的標(biāo)準(zhǔn)。說明所建立的初生珍禽禽流感、新城疫的免疫程序比較合理，這對于國內(nèi)動(dòng)物園建立初生珍禽免疫程序具有重要的借鑒意義。

參與文獻(xiàn)：

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