王瑞華，侯彩婷，鄒昀員，田易玲，劉玉紅，徐凌川

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355)

杜梨(Pyrus betulaefolia Bge.)為薔薇科梨屬落葉喬木，又名棠梨、海棠梨、野梨子、土梨，常作為庭蔭樹、防護(hù)林種植于園林及作為砧木［1］。杜梨各個(gè)部分均有保健價(jià)值［2］，其果實(shí)入藥，具有消食止痢、治腹瀉之效;枝、葉入藥可治霍亂、吐瀉不止、轉(zhuǎn)筋腰痛、反胃吐食;樹皮入藥可治皮膚潰瘍。鞣質(zhì)又稱單寧，是保證杜梨色、香、味的一個(gè)重要成分，是一類比較復(fù)雜的具有沉淀蛋白質(zhì)性質(zhì)的水溶性多元酚類化合物，廣泛存在于植物中。近些年來，隨著分析、分離手段及活性成分研究的進(jìn)步，逐漸發(fā)現(xiàn)鞣質(zhì)具有許多保健價(jià)值［2］及藥理活性［3］，可以抗脂質(zhì)過氧化［4］、清除活性氧［5］，且具有抗艾滋病病毒(HIV)［6］和抗腫瘤［7］等作用，臨床應(yīng)用日益受到重視。

目前關(guān)于杜梨的研究主要集中在種子、幼苗［8－9］，作為砧木嫁接梨樹，杜梨葉氨基酸、礦質(zhì)元素含量測(cè)定［10］，多糖［11］、根皮苷［12］、總黃酮［13］及杜梨果實(shí)揮發(fā)油含量測(cè)定［14］等方面，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同加工方法杜梨葉中的鞣質(zhì)含量，為其加工方法選擇及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品:杜梨葉1#為日曬夜露傳統(tǒng)制法的干燥品，杜梨葉2#為經(jīng)過渥堆發(fā)酵后的干燥品，均為湖南省白沙溪茶廠有限責(zé)任公司質(zhì)檢部提供，粉粹后過40目篩;沒食子酸對(duì)照品(批號(hào) 110831-200803，純度按含C7H6O5計(jì)為90.1%，供含量測(cè)定用)由中國藥品生物制品檢定所提供;其它試劑均為分析純;磷鉬鎢酸試液的配制［15］:取鎢酸鈉100 g，鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸100 mL，磷酸50 mL，加熱回流10 h，放冷，再加硫酸鋰150 g，水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去殘留的溴(約15 min)。冷卻，加水稀釋至1 000 mL，濾過，即得。本液不得顯綠色(如放置后變?yōu)榫G色，可加溴0.2 mL，煮沸除去多余的溴即可)。

1.2 儀器與設(shè)備

Varian Cary 100紫外－可見分光光度計(jì)美國瓦里安公司;KQ500E超聲儀，江蘇昆山超聲儀器有限公司;FA1104萬分之一電子天平，上海精密儀器公司;FW-100高速萬能粉碎機(jī)，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對(duì)照品5 mg，置100 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含沒食子酸0.05 mg)。

1.3.1.2 供試品溶液的制備

分別取不同加工方法的杜梨葉粉末3.5 g，精密稱定，置250 mL棕色容量瓶中，加水150 mL，放置過夜，超聲處理10 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置(使固體物沉淀)，濾過，棄去初濾液50 mL，精密量取續(xù)濾液20 mL，置100 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.2 吸收波長的測(cè)定

取對(duì)照品和供試品溶液各2.0 mL，分別置25 mL棕色容量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液l mL，再分別加水10 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應(yīng)的試劑為空白，于200～800 nm處掃描即得。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 25 mL 棕色容量瓶中，編號(hào)依次為 1 ～6號(hào)，各加入磷鉬鎢酸試液 1 mL，再分別加水 11.5，11，10，9，8，7 mL，用 29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應(yīng)的試劑為空白，參照紫外－可見分光光度法［15］，在吸收波長下測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)線。

1.3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取4號(hào)對(duì)照品顯色后溶液，吸收波長處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，在最大吸收波長處測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。

1.3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品，按供試品溶液的制備方法操作，吸收波長處測(cè)定吸光度，每隔若干時(shí)間測(cè)定一次，連續(xù)考察3 h，共測(cè)定6次，計(jì)算RSD，分析供試品溶液的穩(wěn)定性。

1.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取杜梨葉1#粉末，依上述方法處理樣品6份，按樣品含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算RSD，觀察其重復(fù)性。

1.3.7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取已知鞣質(zhì)含量的供試品(杜梨葉1#粉末2.3 g)6份，精密稱定量，置250 mL棕色容量瓶中，分別加入近等量的沒食子酸對(duì)照品，按供試品溶液制備及1.3.9樣品測(cè)定方法測(cè)定，并計(jì)算鞣質(zhì)的平均回收率及RSD。

1.3.8 最低檢測(cè)限和定量限

該方法測(cè)定最低檢測(cè)限為 0.17 μg/mL，定量限為 0.51 μg/mL。

1.3.9 樣品含量測(cè)定

總酚:精密量取供試樣品溶液2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL。依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)并計(jì)算，即得。

不被吸附的多酚:精密量取供試品溶液25 mL，加至已盛有干絡(luò)素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1 h，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)并計(jì)算，即得。

按下式計(jì)算鞣質(zhì)的含量:鞣質(zhì)含量=總酚量－不被吸附的多酚量。

2 結(jié)果

2.1 吸收波長的測(cè)定

對(duì)照品溶液及樣品溶液在760 nm處均有最大吸收，故確定其吸收波長為760 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在760 nm下測(cè)定對(duì)照品溶液吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程為:Y=0.0009X+0.004 1，r=0.997 9，結(jié)果表明沒食子酸在1～10 μg/mL之間呈良好線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

在波長760 nm處測(cè)定吸光度，RSD=0.31%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

待供試品溶液顯色后，在760 nm下測(cè)定吸光度，每隔若干時(shí)間測(cè)定一次，連續(xù)考察3 h，共測(cè)定6次，結(jié)果表明供試品溶液顯色后在30 min內(nèi)吸收度上升較大，在30～60min內(nèi)吸光度穩(wěn)定，吸光度RSD=0.47%。表明供試品溶液在30～60 min穩(wěn)定，故選擇在30～60 min內(nèi)測(cè)定。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

供試品溶液顯色后，在760 nm下按樣品含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度，RSD=1.27%(n=6)，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

已知鞣質(zhì)含量的供試品溶液加入近等量的對(duì)照品，在760 nm下按供試品溶液制備及1.3.9項(xiàng)下樣品測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算得鞣質(zhì)的平均回收率為98.58%，RSD=0.51%(n=6)。結(jié)果見表1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of gallic acids

表1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Spike recovery rate of tannin in the leaves of Pyrus betulaefolia Bge.and RSD

2.7 樣品中鞣質(zhì)的含量測(cè)定

供試品溶液顯色后，在760 nm下按樣品含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度，杜梨葉1#鞣質(zhì)含量為0.58% ～0.62%，鞣質(zhì)平均含量為0.60%，RSD=2.64%(n=5);杜梨葉2#未檢測(cè)出鞣質(zhì)。結(jié)果表明，傳統(tǒng)制法的杜梨葉鞣質(zhì)含量高于渥堆發(fā)酵后的。樣品中鞣質(zhì)的含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 不同加工方法杜梨葉中鞣質(zhì)的含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination result of tannin in the leaves of Pyrus betulaefolia Bge.with different processing methods

3 討論

現(xiàn)有中藥鞣質(zhì)的含量測(cè)定方法比較多，最常見的有皮粉法、干絡(luò)素法、絡(luò)合量法、比色法和磷鉬鎢酸－干絡(luò)素法［16］。皮粉法是現(xiàn)在國際上較公認(rèn)的測(cè)定方法，但樣品耗用量大，測(cè)定時(shí)間長且無選擇性，測(cè)定結(jié)果往往偏高，一般只適用于鞣質(zhì)含量較高的生藥，而且皮粉試劑的供應(yīng)和質(zhì)量都較難保證。磷鉬鎢酸－干絡(luò)素法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性及靈敏度高，實(shí)驗(yàn)周期短，操作簡(jiǎn)單［17］。2005及2010年版《中華人民共和國藥典》中鞣質(zhì)含量測(cè)定方法皆為磷鉬鎢酸－干絡(luò)素法，故本實(shí)驗(yàn)選擇該方法測(cè)定杜梨葉中的鞣質(zhì)含量。由于鞣質(zhì)易氧化，所以實(shí)驗(yàn)應(yīng)在避光條件下操作。因鞣質(zhì)受熱不穩(wěn)定，故選用室溫浸提過夜提取。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同加工干燥方法所測(cè)得杜梨葉中鞣質(zhì)含量有所不同，其中未發(fā)酵杜梨葉中鞣質(zhì)平均含量為0.60%，渥堆發(fā)酵干燥的杜梨葉檢測(cè)到有信號(hào)，但未測(cè)出鞣質(zhì)含量。原因可能是杜梨葉在渥堆發(fā)酵加工過程中的高溫使其鞣質(zhì)發(fā)生一系列的氧化、聚合、縮合反應(yīng)，產(chǎn)生大量的水溶性氧化產(chǎn)物(主要是色素類多酚)和非水溶性轉(zhuǎn)化物(主要是與蛋白質(zhì)結(jié)合的不溶性大分子物質(zhì))［18］，使發(fā)酵后杜梨葉中的多酚類物質(zhì)減少，致使鞣質(zhì)含量極低，不易檢測(cè)出;另一方面在渥堆發(fā)酵過程中經(jīng)微生物的作用，鞣質(zhì)降解，但具體原因還有待進(jìn)一步研究。因此，在選擇這兩種加工方法時(shí)，如果杜梨葉煎煮后的口感和色澤差別不大，宜選擇日曬夜露傳統(tǒng)的加工方法。

［1］渝德浚.中國植物志［M］.北京:科學(xué)出版社，1974:366.

［2］李娜，楊文慧，王明，等.杜梨養(yǎng)生保健價(jià)值淺談［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(32):19803，19805.

［3］栗世婷，張曉霞，吳蓉瑛.鞣質(zhì)藥理活性的研究進(jìn)展［J］.疾病監(jiān)測(cè)與控制雜志，2010，4(7):395－397.

［4］張杰，詹炳炎，姚學(xué)軍.中藥石榴皮對(duì)生殖器疤疹病毒的滅活作用及其機(jī)理探討［J］.中國中藥雜志，1995，20(9):556－558.

［5］陳會(huì)良，商常發(fā).抗衰老中藥對(duì)自由基清除作用的研究進(jìn)展［J］.中國中醫(yī)藥雜志，2007，5(7):14－17.

［6］張朝鳳，孫啟時(shí)，王崢濤，等.烏藥莖中鞣質(zhì)成分及其抗HIV-1整合酶活性研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2003，38(12):911－914.

［7］趙小亮，周忠波，白紅進(jìn)，等.杜梨果實(shí)熱水提取物對(duì)H22小鼠的抗腫瘤作用［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18(12):2897－2898.

［8］程奇，吳翠云，阿依買木.不同處理對(duì)梨種子休眠與萌發(fā)的影響［J］.塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，17(1):28－30.

［9］劉潤進(jìn)，袁玉清，祝軍.杜梨幼苗根系生長狀況觀察［J］.萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，15(3):180－183.

［10］趙小亮，鄧芳，王金磊，等.杜梨葉片中氨基酸及礦質(zhì)元素含量的測(cè)定［J］.塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，19(2):57－59.

［11］王少杰，張嶺苓，徐凌川，等.不同加工方法的棠梨葉中總多糖含量測(cè)定［J］.山東科學(xué)，2011，24(4):15－17，49.

［12］殷法杰，秦國培，蔣海強(qiáng)，等.杜梨葉中根皮苷含量測(cè)定［J］.山東中藥雜志，2011，30(3):200，215.

［13］張嶺苓，李楠，徐凌川，等.不同炮制方法的杜梨葉中總黃酮含量測(cè)定［J］.食品科技，2011(10):269－271.

［14］吳瑛，趙小亮.杜梨果實(shí)揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(19):5659－5660.

［15］曾元兒.中國藥典2010版(一部)［M］.廣州:中山大學(xué)出版社，2010.

［16］厲博文，張東，劉為廣，等.紫萁貫眾中鞣質(zhì)的含量測(cè)定［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17(11):45－46.

［17］王珅，魯靜.中藥材中鞣質(zhì)含量測(cè)定方法的研究［J］.中國藥事，2004，18(6):361－364.

［18］劉小玲，李穎，姜元欣，等.廣西六堡茶主要特征成分分析［J］.北京工商大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，30(1):46－50.