徐萬(wàn)紋 ，史贏 ，王雄 ，范智峰 ，雷鐵池

（1.湖北省武漢市第三醫(yī)院，武漢430060；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060）

白癜風(fēng)是一種常見的后天色素脫失性皮膚病[1-2]。雖然該疾病不會(huì)導(dǎo)致受累皮膚出現(xiàn)明顯的器質(zhì)性功能障礙，但可對(duì)患者的身心健康造成嚴(yán)重影響，甚至阻礙患者的社會(huì)交往與擇業(yè)就業(yè)[2]。白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制至今仍不完全清楚，臨床上治療困難。由于毛囊隆突區(qū)細(xì)胞被認(rèn)為存在免疫赦免（immune privilege）[3]，隆突區(qū)儲(chǔ)存的黑素干細(xì)胞（melanocyte precusor）在疾病發(fā)生中可能免遭破壞。這樣如何誘導(dǎo)有毛皮膚的白斑皮損出現(xiàn)毛囊復(fù)色（perifollicular repigmentation）是治療成功的關(guān)鍵[4-5]。有研究顯示白癜風(fēng)患者對(duì)各種療法的無(wú)效率可高達(dá)50%[6]。推測(cè)原因可能關(guān)系到患者在接受治療前，臨床醫(yī)師無(wú)法評(píng)估皮損處的毛囊隆突區(qū)是否還存在可被誘導(dǎo)成熟的黑素干細(xì)胞。本研究用針尖皮膚切削術(shù)結(jié)合RT-PCR技術(shù)檢測(cè)白癜風(fēng)皮損組織中黑素細(xì)胞譜系標(biāo)記基因表達(dá)，旨在建立一種預(yù)測(cè)白癜風(fēng)皮損可能出現(xiàn)毛囊復(fù)色的準(zhǔn)確微創(chuàng)方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 該研究獲得武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。選取4例健康志愿者和6例就診于武漢大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科的皮損處于靜止期白癜風(fēng)患者，所有受試者均簽署醫(yī)療知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 針尖皮膚切削術(shù)（needle biopsy）取材方法建立 患處皮膚常規(guī)活力碘液消毒后，75%醫(yī)用乙醇脫碘，鋪手術(shù)洞巾，暴露皮損區(qū)域及部分周圍正常皮膚，對(duì)白斑的中心、近邊緣和周邊“正常皮膚”處皮膚活檢。具體方式：用1 mL卡介苗注射器吸取2%利多卡因溶液0.5 mL，在取標(biāo)本處皮下緩慢注射形成皮丘。針尖將皮丘輕輕挑起，手術(shù)刀平行皮膚表面切除皮丘頂端表皮（面積約為3～4 mm2），見點(diǎn)狀出血，用無(wú)菌紗布?jí)浩戎寡?。直接將皮膚組織標(biāo)本置入預(yù)裝有50 μL冷Trizol試劑（美國(guó)Invitogene公司）的EP管，用分析天平稱重。每次取標(biāo)本前更換新的注射器、刀片和止血紗布，以避免基因污染。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè) 用微量電動(dòng)組織勻漿器（美國(guó)Kontes公司）對(duì)EP管中的皮膚組織進(jìn)行勻漿，參照Trizol試劑說明書提取標(biāo)本組織總RNA。用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）合成第一鏈cDNA。用Dct和Tyr引物行PCR實(shí)驗(yàn)（引物序列見表1），內(nèi)參照物為β-actin，以檢測(cè)皮損標(biāo)本是否有相應(yīng)基因的表達(dá)。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，72℃終延伸2 min，其中變性到延伸過程循環(huán)35次。

2 結(jié)果

2.1 針尖皮膚切削術(shù)結(jié)合RT-PCR技術(shù)檢測(cè)皮膚組織中黑素細(xì)胞譜系標(biāo)記基因方法的建立 用針尖皮膚切削術(shù)獲取3 mg和7 mg的組織標(biāo)本并與負(fù)壓吸皰法采集的表皮片進(jìn)行比較，結(jié)果顯示針頭切削術(shù)獲取的7 mg組織，經(jīng)Trizol法抽提到的總RNA，能在正常皮膚組織中檢測(cè)到多巴色素異構(gòu)酶（Dct）、酪氨酸酶（Tyr）和管家基因β-肌動(dòng)蛋白（ACTB）3種基因mRNA的表達(dá)。而在吸皰皮片中不能測(cè)到這些基因的表達(dá)。同時(shí)對(duì)10例針尖皮膚切削術(shù)后的局部傷口愈合進(jìn)行了追蹤隨訪，1個(gè)月后10例均正常愈合，未見瘢痕形成，見圖1。

表1 黑素細(xì)胞相關(guān)基因引物序列

2.2 白癜風(fēng)皮損組織中黑素細(xì)胞譜系標(biāo)記基因的檢測(cè) 本研究通過對(duì)6例白癜風(fēng)患者18塊組織標(biāo)本進(jìn)行黑素細(xì)胞譜系標(biāo)記基因的檢測(cè)，結(jié)果皮損中心區(qū)檢測(cè)到3種模式，1例為：Dct+Tyr-ACTB+，見圖 2；4例為：Dct-Tyr-ACTB+；1例為：Dct+Tyr+ACTB+。對(duì)1例檢測(cè)結(jié)果為“Dct+Tyr-ACTB+”的患者隨訪，用希蘭UV308準(zhǔn)分子光療饑（日本牛尾公司產(chǎn)）照射（200和300 mJ/cm2）2次，皮損即出現(xiàn)毛囊復(fù)色，見圖3。

3 討論

臨床觀察發(fā)現(xiàn)有著色毳毛（黑毛）的白癜風(fēng)皮損較有脫色毳毛（白毛）的皮損更易誘導(dǎo)出復(fù)色，且受累皮損發(fā)生在無(wú)毛區(qū)域（肢端型）較在有毛區(qū)域（尋常型）對(duì)復(fù)色誘導(dǎo)治療更顯抵抗[7]。在白癜風(fēng)疾病發(fā)生過程毛囊內(nèi)受免疫赦免而保護(hù)的殘存黑素細(xì)胞主要是一群無(wú)色素黑素細(xì)胞（amelanotic melanocyte），存在于毛囊的外毛根鞘，推測(cè)這群細(xì)胞活化可能參與白癜風(fēng)毛囊復(fù)色[5，8]。最近的研究顯示毛囊隆突區(qū)還可能存在有神經(jīng)嵴衍生黑素干細(xì)胞 （neural crest-derived melanocyte stem cells，NSMSC），在體外用窄譜UVB可誘導(dǎo)NS-MSC分化為成熟黑素細(xì)胞，這一機(jī)制被認(rèn)為也可能參與白癜風(fēng)毛囊復(fù)色[9]。

Dct，小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）和干細(xì)胞因子受體（c-Kit）等被認(rèn)為是神經(jīng)嵴干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎ㄏ蚍只某珊谒丶?xì)胞（melanoblast）的特異性標(biāo)記蛋白[10-12]。Nishimura等[11-12]用Dct啟動(dòng)子控制半乳糖苷酶（Lac Z）報(bào)告基因表達(dá)構(gòu)建Dct-Lac Z轉(zhuǎn)基因小鼠，Dct-Lac Z陽(yáng)性細(xì)胞被視為進(jìn)入黑素細(xì)胞譜系分化的最早期成黑素細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dct-Lac Z陽(yáng)性細(xì)胞專一存在于被立毛肌附著的毛囊隆突區(qū)，不含黑素顆粒和酪氨酸酶，呈小卵圓形。本研究用針尖皮膚切削術(shù)結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）技術(shù)檢測(cè)白癜風(fēng)皮損組織中是否存在黑素細(xì)胞譜系標(biāo)記基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在白癜風(fēng)皮損中心區(qū)檢測(cè)出3種基因表達(dá)模式，即Dct+Tyr-ACTB+，Dct-Tyr-ACTB+和 Dct+Tyr+ACTB+。“Dct+Tyr-ACTB+”提示皮膚組織中可能存在有無(wú)色素黑素細(xì)胞；“Dct-Tyr-ACTB+”提示組織中完全缺乏成熟或幼稚黑素細(xì)胞；“Dct+Tyr+ACTB+”提示組織中可能存在功能障礙的黑素細(xì)胞。對(duì)1例檢測(cè)結(jié)果為“Dct+Tyr-ACTB+”的患者追蹤隨訪，用UV308準(zhǔn)分子光照射（200 mJ/cm2和 300 mJ/cm2）2 次，皮損即觀察到出現(xiàn)毛囊復(fù)色。此外，我們還比較了針尖皮膚切削術(shù)與負(fù)壓吸皰法皮膚活檢對(duì)黑素細(xì)胞譜系標(biāo)記基因檢測(cè)的影響。結(jié)果顯示負(fù)壓吸皰法不能檢測(cè)出上述標(biāo)記基因，推測(cè)負(fù)壓吸皰致表皮裂解位置可能不能達(dá)到毛囊隆突區(qū)深度[13]。

總之，用針尖皮膚切削術(shù)結(jié)合RT-PCR技術(shù)檢測(cè)白癜風(fēng)皮損組織中黑素細(xì)胞譜系標(biāo)記基因表達(dá)，可作為預(yù)測(cè)白癜風(fēng)皮損出現(xiàn)毛囊復(fù)色的一種準(zhǔn)確微創(chuàng)方法。臨床上需要進(jìn)一步大樣本測(cè)試與驗(yàn)證基因檢出結(jié)果與誘導(dǎo)出現(xiàn)毛囊復(fù)色的關(guān)聯(lián)性，為白癜風(fēng)病人臨床個(gè)體化治療提供實(shí)驗(yàn)室參考依據(jù)。

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