曹露，婁曉盈，牟娜娜，張泉，譚紅梅

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，廣州 510080）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是蛋氨酸轉(zhuǎn)甲基過程中的一個(gè)產(chǎn)物，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。臨床上，血漿Hcy正常濃度為5～15μmol／L，HHcy被定義為血漿 Hcy濃度在15 μmol／L以上［2］。體內(nèi)外的研究［3－5］表明 Hcy與腎小球的損傷有一個(gè)緊密的聯(lián)系。葉酸（folic acid，F(xiàn)A）是人體必需的維生素，在Hcy與蛋氨酸之間的相互轉(zhuǎn)化過程中充當(dāng)一碳單位的載體，在Hcy再次甲基化到蛋氨酸的過程中發(fā)揮重要的作用。大量研究觀察發(fā)現(xiàn)Hcy水平和FA水平呈現(xiàn)一個(gè)相反的關(guān)系，更進(jìn)一步的研究實(shí)驗(yàn)［6－8］顯示FA能夠降低血透病人、慢性腎移植、晚期腎病患者血漿Hcy濃度。在眾多促進(jìn)腎小球病變的因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β（transforming growth factor－β，TGF－β）可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，與腎臟纖維化和硬化的發(fā)生密切相關(guān)，但是對(duì)TGF－β在Hcy介導(dǎo)的腎小球損傷中的作用研究還不夠充分，F(xiàn)A能否降低Hcy導(dǎo)致的腎小球損傷以及TGF－β是否參與了這一過程還沒有得出確定的結(jié)論。眾所周知，腎小球系膜細(xì)胞是腎小球中非常活躍的細(xì)胞，具有收縮、支持、吞噬和分泌腎素的作用，對(duì)腎小球發(fā)揮正常功能具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)人腎臟系膜細(xì)胞（human renal mesangial cells，HMCs）來進(jìn)行研究，觀察Hcy對(duì)HMCs增殖的影響和葉酸的干預(yù)作用，以及TGF－β、ERK是否參與了這一過程。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司，鼠抗人TGF－β單克隆抗體、鼠抗人ERK單克隆抗體及鼠抗人β－肌動(dòng)蛋白（β－actin）單克隆抗體，購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠抗體（evision two－stepTManti－mouse detection reagent，HRP）購(gòu)自 Antibody Diagnostica Inc公司；噻 唑 藍(lán) （methylthiazolyldiphenyl－tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)于Sigma－Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HMCs，調(diào)整細(xì)胞密度，以1×104／孔接種于96孔板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，細(xì)胞匯合度達(dá)50%～60%以上時(shí)，加入不同濃度的Hcy（0、200、400、600、800、1 000μmol／L）或 Hcy（400μmol／L）加不同濃度的 FA（50、100、200 μmol／L）處理24h，PBS輕輕洗滌，加入180μL新鮮培養(yǎng)液，再加入20μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，每孔加入150μL DMSO，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492nm處測(cè)量各孔的吸光值。

1.2.2 Western blot法檢測(cè) TGF－β和 ERK 的表達(dá) 以2×105／mL的密度接種HMCs，待細(xì)胞貼壁后，以不同的Hcy濃度、Hcy加不同濃度的FA處理細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，RIPA裂解液裂解，超聲破碎，Bio－RAD蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，在聚丙酰胺凝膠中電泳后，250mA恒流濕轉(zhuǎn)蛋白于硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，ERK一抗（1∶1 000），TGF－β一抗（1∶1 000）孵育過夜后，TBST洗3次，二抗孵育1h，TBST洗3次，膜鋪于曝光盒中，將適量的發(fā)光液滴在膜上，于暗室中曝光、顯影。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)HMCs存活率進(jìn)行方差分析，采用TEST分析法對(duì)不同濃度的Hcy處理后和Hcy與不同濃度FA共同處理后各組間差異進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 Hcy誘導(dǎo)HMCs細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Hcy處理后劑量依賴性地促進(jìn)細(xì)胞增殖（見圖1）。Hcy 400 μmol／L時(shí)增殖明顯（P＜0.01），選取400μmol／L濃度的Hcy進(jìn)行葉酸干預(yù)作用的研究。

圖1 Hcy誘導(dǎo)HMCs細(xì)胞增殖不同濃度Hcy處理HMCs 24h，采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞活力。與對(duì)照組（Hcy＝0）比較，＊P＜0.05，＃P＜0.001

2.2 FA抑制Hcy誘導(dǎo)的HMCs細(xì)胞增殖

加入不同劑量FA干預(yù)后，與Hcy 400μmol／L組對(duì)比，HMCs細(xì)胞增殖能力呈現(xiàn)劑量依賴性地下降（見圖2）。

2.3 Hcy增強(qiáng)TGF－β和ERK蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，對(duì)照組TGF－β和ERK微量表達(dá)；Hcy處理后，隨著劑量的升高，TGF－β和ERK的表達(dá)依次增強(qiáng)（見圖3）。

2.4 FA抑制Hcy誘導(dǎo)的TGF－β和ERK蛋白表達(dá)

使用FA干預(yù)后，與400μmol／L濃度的 Hcy組比較，TGF－β和ERK的表達(dá)下降，并呈劑量依賴趨勢(shì)（見圖4）。

3 討論

McCully于1969年最先將重度HHcy（100～450μmol／L）與動(dòng)脈粥樣硬化疾病相聯(lián)系，重度HHcy是由于參與Hcy代謝的轉(zhuǎn)甲基或轉(zhuǎn)硫作用的酶缺陷所致，常見的有胱硫酶合成酶及亞甲基四氫葉酸還原酶缺陷，重度HHcy病人有早發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化，動(dòng)靜脈栓塞及智力障礙。Ingram等［5］用體外培養(yǎng)的Sprague－Dawley大鼠的系膜細(xì)胞，首次研究證實(shí)Hcy在腎小球病變中發(fā)揮的作用和在血管病變中發(fā)揮的作用是一致的，提出Hcy在慢性腎臟病變的進(jìn)展中發(fā)揮著潛在性作用，ERK的激活參與了Hcy導(dǎo)致的腎損傷的過程。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)增加的Hcy水平也能直接作用腎小球的細(xì)胞，引起腎小球的損傷和最終的硬化。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的HMCs，遺傳缺陷性劑量的Hcy，測(cè)定細(xì)胞活力、ERK和TGF－β的蛋白表達(dá)量。MTT檢測(cè)顯示Hcy明顯刺激了HMCs的增殖并且有劑量依賴的關(guān)系，同時(shí)觀察到Hcy處理的HMCs，ERK的蛋白表達(dá)量升高。有文獻(xiàn)［9］報(bào)道ERK通路的阻礙引起HMCs增殖的明顯降低。進(jìn)一步的報(bào)道［10］表明ERK通路的激活在腎小球損傷的過程中的作用與細(xì)胞的增殖相關(guān)。無論是動(dòng)物模型還是人類疾病，TGF－β被認(rèn)為是一個(gè)多器官病理變化的發(fā)病機(jī)制，在同型半胱氨酸血癥的模型中，增加的TGF－β的蛋白表達(dá)量升高不僅發(fā)生在心臟，還發(fā)生在肺和肝臟，許多研究證實(shí)TGF－β作為腎小球硬化關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)因子，其水平升高與腎小球的病變過程相聯(lián)系，也有研究［11］提出TGF－β和ERK的潛在性聯(lián)系，誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖的發(fā)生，但是TGF－β與Hcy導(dǎo)致的腎臟損傷之間的關(guān)系還沒有完全被證實(shí)。我們的實(shí)驗(yàn)觀察到在Hcy處理后TGF－β的表達(dá)與對(duì)照組相比有明顯的變化。FA的保護(hù)作用在心血管方面的研究最為廣泛，在腎臟損傷的保護(hù)中也具有重要的臨床意義，但是FA對(duì)Hcy導(dǎo)致的腎臟損傷的保護(hù)機(jī)制還沒有得到證實(shí)，TGF－β是否參與FA對(duì)Hcy導(dǎo)致的腎損傷保護(hù)的報(bào)道更少。本實(shí)驗(yàn)采用體外的細(xì)胞模型，在400μmol／L Hcy損傷的基礎(chǔ)上用不同濃度的FA進(jìn)行干預(yù)，觀察到FA能抑制Hcy誘導(dǎo)的HMCs細(xì)胞增殖，TGF－β蛋白表達(dá)也相應(yīng)下降。通過實(shí)驗(yàn)得出TGF－β和ERK可能參與了FA抑制Hcy誘導(dǎo)的HMCs細(xì)胞增殖作用。

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