湯小蕾

(浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校,浙江寧波315100)

婦痛定顆粒由黃芪、當(dāng)歸、延胡索等組成,最早來(lái)源于古方“三神丸”,后通過(guò)臨床應(yīng)用的增減衍化而來(lái),具有補(bǔ)血益氣、活血通絡(luò)、調(diào)經(jīng)止痛的功效,可用于氣血不足引起的各種痛經(jīng)、閉經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等證,臨床療效顯著。本文通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定其最佳提取工藝,并參照《中國(guó)藥典》2010版一部,采用高效液相色譜和蒸發(fā)光檢測(cè)器測(cè)定婦痛定顆粒中黃芪的活性成分黃芪甲苷,采用高效液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定延胡索乙素,以建立該藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 試驗(yàn)材料

Waters2695系列高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司),EMPOWER化學(xué)工作站,2487雙通道紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(Altech 2000),Agela C18色譜柱(5 μ m,250 mm ×4.6 mm),Sartorius CP225D 型電子天平(美國(guó)Sartorius公司),DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。婦痛定顆粒樣品(批號(hào):110901、110902、110903),由寧波遠(yuǎn)志生物科技有限公司提供;黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)0789-201028,供含量測(cè)定用),延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào)0881-201118,供含量測(cè)定用)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所;薄層層析硅膠G板(青島海洋化工廠);甲醇為色譜純(美國(guó)Sigma-Aldrich公司),磷酸為分析純,水為超純水,其余試劑均為分析純。

2 薄層鑒別

2.1 黃芪薄層色譜鑒別 取本品10 g,研成細(xì)粉,加甲醇40 mL,超聲處理30 min,過(guò)濾,取續(xù)濾液蒸干,殘?jiān)铀?20 mL使溶解,用正丁醇萃取3次,每次20 mL,合并正丁醇萃取液,用氨水洗滌2次,每次30 mL。棄去氨水溶液,再用水洗滌3次,每次50 mL,棄去水液,正丁醇液蒸干,殘?jiān)蛹状? mL溶解即得供試品溶液。另按處方量的藥材及輔料除去黃芪同法制成缺黃芪的陰性樣品溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各5 μ L,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以氯仿—醋酸乙酯—甲醇—水(15∶40∶20∶10)10 ℃下放置的下層溶液為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示,供試品色譜中與黃芪甲苷對(duì)照品在相同位置上顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性對(duì)照品無(wú)干擾。

2.2 當(dāng)歸的薄層色譜鑒別 取本品5 g,研細(xì)粉,加乙醚20 mL,超聲處理20 min,過(guò)濾,取續(xù)濾液蒸干,殘?jiān)右掖? mL溶解得供試品溶液。另按處方量的藥材及輔料除去當(dāng)歸同法制成缺當(dāng)歸的陰性樣品溶液。取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.5 g,同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述溶液各10 μ L,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,至紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示,供試品色譜中與當(dāng)歸對(duì)照藥材在相同位置上顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.3 延胡索乙素的薄層色譜鑒別 取本品10 g,研細(xì)粉,加甲醇30 mL,超聲處理30 min,過(guò)濾,取續(xù)濾液蒸干,殘?jiān)铀?0 mL使溶解,用濃氨水調(diào)節(jié)pH至10～11,加乙醚萃取2次,每次20 mL,合并乙醚液,蒸干,殘?jiān)蛹状? mL溶解得供試品溶液。另按處方量的藥材及輔料除去當(dāng)歸同法制成缺當(dāng)歸的陰性樣品溶液。取延胡索乙素對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各5 μ L,分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上,以正己烷-丙酮(8∶2)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出 ,晾干,碘蒸氣熏3 min,取出,揮盡碘后,置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示,供試品色譜中與延胡索乙素在相同位置上顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性對(duì)照無(wú)干擾[4]。

3 含量測(cè)定

3.1 延胡索乙素的含量測(cè)定

3.1.1 溶液制備 對(duì)照品溶液制備:精密稱定胡索乙素對(duì)照品適量,加流動(dòng)相制成每1mL含15 μ g的溶液。供試品溶液制備:精密稱取本品3 g,研細(xì),加入甲醇25mL。稱定重量,回流30 min,加甲醇補(bǔ)足失去的重量,濾過(guò),精密吸取續(xù)濾液 15 mL,蒸干,殘?jiān)铀?0 mL使溶解,用氨水調(diào)節(jié)pH到9～10,加石油醚(60～90℃)振搖提取4次,每次20 mL,合并提取液,蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?并轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,即得。陰性樣品溶液:另按處方量的藥材及輔料除去當(dāng)延胡索同制成缺當(dāng)歸的陰性樣品,再同“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法操作,即得。

3.1.2 色譜條件 采用Agela C18(5 μ m,250 mm×4.6 mm)色譜柱,以甲醇—0.1%磷酸溶液(用三乙胺調(diào)節(jié) pH至 5.0)(60∶40)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm,進(jìn)樣量10 μ L。理論板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

3.1.3 線性范圍的考察 精密稱取延胡索乙素對(duì)照品5.1 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,再?gòu)闹蟹謩e取1.5,3,4.5,6,7.5 mL分別置于10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。分別吸取上述各溶液10 μ L注入液相色譜儀,測(cè)定峰面積。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo),得延胡索乙素的回歸方程為:Y=489.2X-2 136.6,r=0.999 4。結(jié)果表明:延胡索乙素在0.061 1～0.308 μ g范圍有良好的線性關(guān)系。

3.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液各10 μ L,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果延胡索乙素峰面積的RSD(n=6)為1.9%。

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào):110901)10 μ L,按上述色譜條件分別于0,1,2,4,8,24 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果延胡索乙素峰面積的RSD(n=6)為1.2%。

3.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品(批號(hào)110901),分別取6份,每份約3 g。照“3.1.1.2”項(xiàng)下方法處理得供試品溶液,依上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果樣品中延胡索乙素的平均含量(n=6)為0.101 4 mg/g,RSD為0.9%。

3.1.7 回收率試驗(yàn) 取“3.1.7”項(xiàng)下的細(xì)粉 9份,每份1.5～2.5 g(含延胡索乙素為0.101 4 mg/g),精密稱定。分別精密加入延胡索乙素對(duì)照品適量,照“3.1.1.2”項(xiàng)下方法處理得供試溶液,依上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算延胡索乙素平均回收率(n=9)為98.85%,RSD為1.7%。

3.1.8 樣品測(cè)定 精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μ L,依上述色譜條件測(cè)定,每袋樣品測(cè)定3份,以外標(biāo)法計(jì)算含量,取其含量平均值,見(jiàn)表1。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果 mg/袋

3.2 黃芪甲苷的含量測(cè)定

3.2.1 溶液制備 對(duì)照品溶液制備:取黃芪甲苷對(duì)照品適量,精密稱定,加流動(dòng)相制成每含量為0.196 0 mg/g的溶液,即得。供試品溶液制備:取本品10袋的內(nèi)容物,研細(xì)。取細(xì)粉約5.0 g,精密稱定,置索氏提取器中,加甲醇50 mL,冷浸過(guò)夜,再加甲醇適量,加熱回流提取4 h,提取液回收甲醇并濃縮至干,殘?jiān)铀?0mL微熱使溶解,加水飽和的正丁醇振搖提取4次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨試液充分洗滌2次,每次40 mL,氨試液棄去,正丁醇液水蒸干,用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用0.45 μ m微孔薄膜過(guò)濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液[3-5]。陰性樣品溶液:另按處方量的藥材及輔料除去當(dāng)黃芪同制成缺當(dāng)歸的陰性樣品,再同“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法操作,即得。

3.2.2 色譜條件 色譜柱:Prodigy 5u C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm,5 μ m),流動(dòng)相 :乙腈-水(35∶65),流速:1.0 mL/min,柱溫:24℃。ELSD參數(shù):飄移管溫度100℃,氮?dú)饬魉?.5 mL/min。

在上述條件下,黃芪甲苷與樣品中其它組分色譜峰可達(dá)基線分離,其分離度大于1.5,理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算在4 000以上。

3.2.3 線性范圍的考察 分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液4,6,8,10,16,20 μ L進(jìn)樣,測(cè)定其峰面積積分值,以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),峰面積積分值的對(duì)數(shù)值縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得黃芪甲苷的回歸方程為:Y=1.69X-7.54,r=0.999 6。結(jié)果表明黃芪甲苷在進(jìn)樣量2.041～10.202 μ g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液20 μ L,重復(fù)進(jìn)樣 6次,測(cè)定其峰面積積分值,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)為 1.59%,表明儀器精密度良好。

3.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液20 μ L,于 0、1 、2、4、8、24 h 進(jìn)樣,測(cè)定其黃芪甲苷峰面積積分值,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)為1.42%。結(jié)果表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

3.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào):110901)約5.0 g,共6份,按上述條件,測(cè)定其黃芪甲苷含量。結(jié)果平均含量為0.196 0 mg/g,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.67%。

3.2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(含量為0.196 0 mg/g)約2.5 g 9份,置索氏提取器中,分別精密加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液(0.50 mg/mL)9.0,10.0,11.0 mL各2份,然后按上述方法制備供試品溶液,并測(cè)定含量,計(jì)算回收率,平均回收率為98.10%,RSD為0.87%。

3.2.8 樣品測(cè)定 精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μ L,按上述色譜條件測(cè)定3批樣品中黃芪甲苷的含量,取其含量平均值,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果 mg/g

4 小結(jié)

黃芪甲苷成分在紫外條件只有末端吸收,最大吸收波長(zhǎng)為200.8 nm。如用紫外檢測(cè),試劑對(duì)分析影響很大。同時(shí)薄層色譜掃描法的分離效果也不理想,穩(wěn)定性和重現(xiàn)性相對(duì)較差且操作繁瑣。黃芪藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)目前文獻(xiàn)報(bào)道以及《中國(guó)藥典(2005年版)》均采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)法進(jìn)行定量分析。ELSD檢測(cè)器為質(zhì)量型檢測(cè)器,不受外部環(huán)境干擾,試劑在檢測(cè)器中全部蒸發(fā),檢測(cè)靈敏度、穩(wěn)定性及重復(fù)性能夠符合含量測(cè)定的要求,且操作簡(jiǎn)便,是一種檢測(cè)制劑中黃芪甲苷成分的有效分析方法。另實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)外界溫度變化會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果,造成出峰時(shí)間漂移,電壓變化也會(huì)引起基線不穩(wěn)等情況。

根據(jù)上述3批樣品的含量測(cè)定結(jié)果,計(jì)算3批樣品含量平均值為0.212 3 mg/g,即2.123 0 mg/袋,考慮到實(shí)際大生產(chǎn)中提取轉(zhuǎn)移率及損耗等問(wèn)題,按平均含量的80%折算,則含量限度可暫定為本品每袋含黃芪甲苷含量應(yīng)不得低于1.70 mg。

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