張學(xué)寧, 高志華, 劉慶忠, 李會(huì)平, 師莉莎

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2. 河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050061；3.山東省果樹研究所，山東泰安 271000)

藍(lán)莓花色苷提取工藝的優(yōu)化研究

張學(xué)寧1, 高志華2, 劉慶忠3, 李會(huì)平2, 師莉莎1

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2. 河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050061；3.山東省果樹研究所，山東泰安 271000)

以體積分?jǐn)?shù)為0.1%的鹽酸乙醇溶液為提取液，探討藍(lán)莓果實(shí)花色苷的最佳提取工藝。采用單因素和正交設(shè)計(jì)來考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)、溫度(C)、時(shí)間(D)、火力(E)在水浴法、微波法和超聲波法3種提取方法中的作用。通過光譜掃描確定了藍(lán)莓花色苷的最大吸收峰在535 nm處，水浴法、超聲波法和微波法提取藍(lán)莓果實(shí)花色苷的最佳工藝分別為A3B3C2D3，A3B2C1D3和A2B2C2E3。品種間花色苷的最適宜提取方法亦有所不同：超聲波法最優(yōu)，適于北陸和喬治2個(gè)品種；微波法次之，適于伯克利品種；水浴法提取效果最差。

藍(lán)莓；花色苷；提取工藝

藍(lán)莓又名藍(lán)果越桔、藍(lán)漿果，為杜鵑花科越桔屬植物。藍(lán)莓果實(shí)呈藍(lán)色，果肉細(xì)膩，果味酸甜，風(fēng)味獨(dú)特，其花色苷等多酚類物質(zhì)是所有水果與蔬菜中含量最高的[1]。藍(lán)莓果實(shí)中的花色苷是品質(zhì)優(yōu)良的天然色素，具有很強(qiáng)的抗氧化性，具有消除自由基、降低血清膽固醇、抗腫瘤、促進(jìn)視網(wǎng)膜上視紅素再合成等生理活性功能[2-3]，可廣泛用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。

花色苷一詞是 MARGUART 在1835年首先用來命名矢車菊花朵中的藍(lán)色提取物時(shí)提出來的，現(xiàn)在為同類物質(zhì)的總稱?；ㄉ詹环€(wěn)定，在植物中主要以花色苷糖配體存在。目前普遍采用的提取方法主要有水浴法[4]、醇提法[5-6]、樹脂法[7]、微波法[8-9]、超聲波法[10]等。藍(lán)莓果中花色苷存在于細(xì)胞內(nèi)或吸附在由纖維素組成的細(xì)胞壁上。常規(guī)的浸提法提取效率低，成本高，且存在溶劑殘留。正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)和響應(yīng)面法已在食品工業(yè)有廣泛的應(yīng)用[11-14]。與響應(yīng)面法相比，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的設(shè)計(jì)方法。為了更有效地開發(fā)藍(lán)莓花色苷資源，筆者采用無毒的乙醇溶劑提取輔助水浴法、超聲波法和微波法，以有助于細(xì)胞的破碎以及花色苷的釋放[10]，采用單因素和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)相結(jié)合對(duì)藍(lán)莓果實(shí)中的花色苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期探索最佳提取工藝，提高花色苷的提取率，篩選出最佳的提取工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1材料

將伯克利(Berkeley)、北陸(Northland)、喬治(Georgiagem)等3個(gè)藍(lán)莓品種的果實(shí)(均采自山東省果樹研究所)采摘后立即冷凍并于-40 ℃保存。實(shí)驗(yàn)開始后，將果實(shí)放入恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，于45 ℃下恒溫烘干果實(shí)至恒重，粉碎后過380 μm (40目)篩子。將過篩的果粉放入干燥器中避光、干燥保存。

1.2花色苷最大吸收峰的確定

精確稱取0.5 g藍(lán)莓果粉，用鹽酸乙醇浸提，真空抽濾，定容至25 mL。取10 mL提取液，用pH值為1.0的溶劑(25 mL 0.2 mol/L KCl+75 mL 0.2 mol/L HCl)定容至25 mL，進(jìn)行光譜掃描，確定最大吸收峰。

1.3提取溶劑的選擇

精確稱取0.5 g藍(lán)莓果粉，在40 ℃、料液比為1 g∶20 mL(簡(jiǎn)稱1∶20,下同) 條件下，分別用表1中提取劑浸提120 min，抽濾并用相應(yīng)的浸提液定容至25 mL。分別取定容好的浸提液10 mL，用pH值為1.0的溶劑定容至25 mL，采用pH值示差法[15]測(cè)定花色苷吸光度值，篩選出合適的提取劑。

表1 花色苷提取劑

注：表1中百分?jǐn)?shù)表示體積分?jǐn)?shù)，下同。

1.4提取方法

取藍(lán)莓果粉每份0.2 g，以乙醇+鹽酸溶液為提取劑，試驗(yàn)前預(yù)處理24 h。設(shè)計(jì)乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù)，下同)、提取時(shí)間、提取溫度、料液比及微波火力的單因素試驗(yàn)，見表2。浸提后抽濾并定容至25 mL，取10 mL提取液，用pH值為1.0的溶劑定容至25 mL。

表2 藍(lán)莓花色苷提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1花色苷最大吸收峰的確定

花色苷在中性和弱堿性溶液中不太穩(wěn)定，提取時(shí)通常采用酸性提取劑，在較低的pH值(<4)時(shí)花色苷的4種主要結(jié)構(gòu)之間存在平衡，有明顯的吸收峰出現(xiàn)[5，16]。孟憲軍等研究認(rèn)為，當(dāng)pH 值分別為1和3時(shí)，溶液吸光度值變化不明顯, 顏色為深紅色[17]。本試驗(yàn)將在酸性(pH值為1.0)提取液中浸提的花色苷在400～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 花色苷吸收峰光譜掃描圖Fig.1 Scan spectrum of blueberry extracts

由圖1可以看出，花色苷最大吸收峰在535 nm處。該結(jié)果與LOHACHOOMPOL等報(bào)道的藍(lán)莓果實(shí)花色苷的最大吸收峰在538 nm處基本一致[18]，但與王秀菊等用藍(lán)莓釀酒果渣中提取的花色苷的最大吸收峰在520 nm處有一定差異[5]。這可能與實(shí)驗(yàn)所選用藍(lán)莓的花色苷的性質(zhì)有關(guān)。

2.2提取劑的選擇

石碧等研究認(rèn)為藍(lán)莓花色苷是水溶性多酚類物質(zhì)，可溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑中[19]。水中加入一定量的乙醇形成多酚復(fù)合體系，更適宜多酚的提取。在相同提取條件下，通過pH值示差法測(cè)定藍(lán)莓花色苷吸光度。不同提取劑的提取結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取劑的提取結(jié)果Fig.2 Test results of anthocyanins extracted with different solvents

如圖2所示，用表1中1，2，3號(hào)提取劑與用4，5，6號(hào)提取劑相比花色苷吸光度差異比較顯著，后三者間差異不顯著?？紤]到甲醇有毒，而乙醇具有溶解性能好、對(duì)植物細(xì)胞穿透能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇了5號(hào)溶劑(80%乙醇+0.1%鹽酸)作為最佳提取劑。

2.3水浴法

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

水浴法單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 水浴法單因素分析Fig.3 Extraction of anthocyanin treated with water-bath affected by different factors

花色苷提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，如圖3 a)所示，其體積分?jǐn)?shù)為60%～90%時(shí)花色苷吸光度都比較高。從節(jié)約乙醇的角度考慮，乙醇適宜體積分?jǐn)?shù)為60%～80%。

料液比的增加能提高分子擴(kuò)散速率、縮短平衡時(shí)間，因而使溶解在提取劑中的花色苷增多，從而增加了提取量。從圖3 b)可以看出，吸光度值在料液比為1∶15時(shí)最大；料液比為(1∶15)～(1∶25)時(shí)提取率變化較小。從提高效果、減少溶劑量和降低濃縮負(fù)荷等方面考慮，料液比為(1∶15)～(1∶20)較為合適。

升溫能提高花色苷的溶解度和擴(kuò)散速度，而且有助于細(xì)胞的破壞、提高細(xì)胞膜的通透性。由于花色苷對(duì)熱敏感，研究人員認(rèn)為當(dāng)溫度超過某一臨界溫度時(shí)會(huì)加速花色苷的氧化和降解，反而使提取率下降[20-23]。從圖3 c)可以看出：當(dāng)溫度小于50 ℃時(shí)，花色苷吸光度值隨時(shí)間的增加逐漸升高，在50 ℃時(shí)花色苷吸光度達(dá)最大值，溫度再高吸光度值開始下降，可能是由于溫度高了出現(xiàn)了降解現(xiàn)象。因此，水浴溫度為40～60 ℃較好。

提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取也越充分。但張華等研究認(rèn)為花色苷易發(fā)生氧化、降解損失，時(shí)間越長(zhǎng)雜質(zhì)越多[24]。從圖3 d)可以看出，花色苷吸光度值隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，在水浴時(shí)間為120 min時(shí)花色苷吸光度達(dá)到最高，時(shí)間再長(zhǎng)吸光度值下降，這可能是出現(xiàn)了降解現(xiàn)象。綜合測(cè)定結(jié)果及時(shí)間效益，超聲時(shí)間為90～150 min較好。

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素分析的結(jié)果進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，如表3所示，各種因素對(duì)提取效果影響的主次順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>時(shí)間>溫度>料液比。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析得知，最佳提取條件應(yīng)為A3B3C2D3，即使用0.1%的鹽酸乙醇溶液，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、料液比為1∶20、溫度為60 ℃條件下，對(duì)藍(lán)莓果粉水浴120 min進(jìn)行花色苷提取，測(cè)定提取的花色苷吸光度值為0.257。該組合低于試驗(yàn)編號(hào)8和編號(hào)9的值，方差分析得出與試驗(yàn)編號(hào)8和編號(hào)9差異不顯著，并且各因素影響順序?yàn)锳>C>D>B，所以選用A3B3C2D3合理。本試驗(yàn)的結(jié)果與王秀菊等的主要差異在于降低了水浴溫度，從而減少了花色苷的降解，同時(shí)提取時(shí)間延長(zhǎng)，使提取效果更充分[5]。

表3 水浴法提取藍(lán)莓花色苷正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4超聲波輔助提取法

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

同水浴的單因素分析原理，根據(jù)圖4超聲波法的單因素處理結(jié)果，花色苷提取選取體積分?jǐn)?shù)為50%～70%的乙醇，料液比為1︰10，1︰15，1︰20，超聲時(shí)間為20，30，40 min，提取溫度為40～60 ℃進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 超聲波輔助提取法單因素分析Fig.4 Extraction of anthocyanin treated with ultrasonic affected by different factors

2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果(見表4)

表4 超聲波輔助提取法提取藍(lán)莓花色苷正交試驗(yàn)結(jié)果

從表4可以看出，各種因素對(duì)提取效果影響的主次順序?yàn)榱弦罕?溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，最佳提取條件為A3B2C1D3，即使用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的鹽酸乙醇溶液，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶15，溫度為60 ℃，超聲波頻率為40 kHz，對(duì)藍(lán)莓粉末超聲20 min進(jìn)行花色苷提取，測(cè)定提取的花色苷吸光度值為0.222。該組合低于實(shí)驗(yàn)編號(hào)3和編號(hào)9。由方差分析得出編號(hào)3和編號(hào)9差異不顯著，并且各因素影響順序?yàn)锽>D>A>C，所以選用A3B2C1D3最佳的提取工藝。

2.5微波提取法

2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖5)

同水浴的單因素分析原理，圖5 a)和圖5 b)中花色苷提取選乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%～80%，料液比為1∶10，1∶15，1∶20進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 微波提取法單因素分析Fig.5 Extraction of anthocyanin treated with microwave affected by different factors

花色苷吸光度與時(shí)間關(guān)系如圖5 c)所示。提取時(shí)間為10 s時(shí)花色苷吸光度值最大，提取時(shí)間大于10 s后吸光度逐漸降低。微波作用時(shí)間越長(zhǎng)，吸光度越高，但微波時(shí)間長(zhǎng)同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致升溫過快，從而使提取液中的乙醇揮發(fā)，所以時(shí)間越短越好。故提取時(shí)間選取5，10，15 s進(jìn)行正交試驗(yàn)。

花色苷吸光度與火力的關(guān)系如圖5 d)所示。由于微波對(duì)細(xì)胞膜具有破碎作用，花色苷吸光度值隨著火力的增大逐漸增加，火力增大到80 kHz時(shí)吸光度值達(dá)到最大，之后開始減小，所以選擇火力控制在60～100 kHz進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.5.2 正交試驗(yàn)結(jié)果(見表5)

從表5可以看出，各種因素對(duì)提取效果影響的主次順序?yàn)榱弦罕?微波時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>火力。最佳提取條件為A2B2C2E3，即使用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的鹽酸乙醇溶液，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶15、火力為100 kHz條件下，對(duì)藍(lán)莓粉末微波10 s進(jìn)行花色苷提取。試驗(yàn)驗(yàn)證該條件下，測(cè)定提取的花色苷吸光度值為0.277，方差分析結(jié)果顯示應(yīng)該選取A2B2C2E3為最優(yōu)組合。

表5 微波法提取藍(lán)莓花色苷正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6其他藍(lán)莓品種花色苷的提取(見表6)

表6 不同藍(lán)莓品種的花色苷吸光度值

應(yīng)用以上3種方法篩選出的最佳工藝條件提取3個(gè)藍(lán)莓品種的花色苷。由表6可以看出，對(duì)于伯克利品種而言，水浴法和超聲波法差異不顯著，微波法差異顯著且更適于該品種。對(duì)于北陸和喬治2個(gè)品種，3種提取方法都有顯著差異，而超聲波法更適于這2個(gè)品種花色苷的提取。目前，關(guān)于藍(lán)莓花色苷的提取方法，提取溶解輔助水浴法的研究較多，但是超聲波法和微波法用于藍(lán)莓花色苷的提取報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這2種提取方法明顯優(yōu)于水浴法，且以超聲波法最佳。

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Optimization of extraction procedure of anthocyanins from blueberry

ZHANG Xuening1, GAO Zhihua2, LIU Qingzhong3, LI Huiping2, SHI Lisha1

(1.School of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang Hebei 050018, China; 2.School of Biological Science and Engineering, Hebei University of Economics and Business, Shijiazhuang Hebei 050061, China; 3.Shandong Institute of Pomology, Tai'an Shandong 271000, China)

The optimum procedure for anthocyanins extraction from blueberry with 0.1% HCl ethanol as solvent was discussed. Orthogonal design and single factor method were used to determine the effects of the concentration of alcohol (A), the material (B), the tradition time(C), the tradition temperature (D) as well as the wave energy (E) in water-bath method, micro-wave method and ultrasonic method. It shows that the maximum absorption wavelength of the pigment is 535 nm. The optimal conditions for water-bath, ultrasonic, and microwave extraction areA3B3C2D3,A3B2C1D3andA2B2C2E3, respectively. The above three combinations were applied to the anthocyanins extraction of three cultivars named Berkeley, Georgiagem and Northland. It shows that the ultrasonic method is better than the other two, the microwave extraction is second better, while water-bath is the last.

blueberry; anthocyanin; extraction procedure

1008-1534(2013)02-0066-07

TS264

A

10.7535/hbgykj.2013yx0115

2012-10-08;

2012-11-20

責(zé)任編輯：張士瑩

河北科技大學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(XL200764)；河北科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(QD200964)；河北科技大學(xué)大學(xué)生科技及創(chuàng)新項(xiàng)目

張學(xué)寧(1976-)，女，河北辛集人，講師，博士，主要從事細(xì)胞工程及其生物活性物質(zhì)方面的研究。

E-mail:xueningzhang@sohu.com