胡東華，王宇光，陳志武，馬增春，梁乾德，肖成榮，譚洪玲，湯響林，高 月

三七總皂苷(panax notoginseng saponin，PNS)是五加科植物三七［Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen］的主要活性成分，其在三七中的含量高達(dá)12%。PNS中三七皂苷 R1、人參皂苷Rb1、Rg1、Rd和Re為其主要成分，約占總皂苷含量的80%［1］，具有防止脂質(zhì)在血管內(nèi)沉積，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，促纖溶及抑制血小板聚集，促進(jìn)微循環(huán)，抗動(dòng)脈粥樣硬化，保護(hù)心肌等作用［2－3］。是臨床用血栓通的主要成份，主要用于擴(kuò)張血管，改善血液循環(huán)。

細(xì)胞色素P450酶(CYP450)最初發(fā)現(xiàn)于肝臟中，其在生物轉(zhuǎn)化、藥物代謝、解毒等方面進(jìn)行廣泛深入的研究;近年來發(fā)現(xiàn)心臟中也含有CYP，并且以CYP2和CYP4家族為代表與心血管疾病密切相關(guān)的CYP亞型也成為研究熱點(diǎn)，內(nèi)源性物質(zhì)花生四烯酸(arachidonicacid，AA)經(jīng)P450酶途徑的代謝產(chǎn)物對(duì)心血管系統(tǒng)的影響近年來日益受到重視［4］。近年來許多CYP家族在心臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中得以鑒定，同時(shí)很多證據(jù)顯示內(nèi)源性物質(zhì)經(jīng)CYP的代謝產(chǎn)物在維持心血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［5］。研究表明，花生四烯酸可被CYP環(huán)氧酶(CYP2C11，2J3)代謝為環(huán)氧二十碳三烯酸(EET)或被 CYP ω-羥化酶(CYP4A，4F)代謝為20-羥基二十碳四烯酸(20-HETE)［6］。

以往對(duì)于PNS的藥理機(jī)制研究主要集中在對(duì)心肌的保護(hù)作用、鈣拮抗作用、對(duì)抗心肌肥大、抑制心室重構(gòu)、抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖、抗血栓形成和抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用、肝臟P450酶等方面［7－9］。目前尚未見 PNS對(duì)心臟細(xì)胞色素P450調(diào)控的研究，鑒于近年來發(fā)現(xiàn)心臟細(xì)胞色素P450在心血管系統(tǒng)中同樣執(zhí)行重要功能，PNS作為治療心腦血管疾病的臨床常用藥物，其對(duì)心肌細(xì)胞色素P450影響和機(jī)制仍不是十分清楚。本研究利用Real Time PCR方法從心臟P450酶的層面考察PNS處理心肌細(xì)胞H9c2，細(xì)胞色素P450亞型表達(dá)的變化，以評(píng)價(jià)PNS對(duì)心臟P450酶亞型是否有抑制或誘導(dǎo)效應(yīng)，為進(jìn)一步深入研究PNS以心臟P450為靶點(diǎn)的心血管藥理效應(yīng)的機(jī)制提供線索，同時(shí)為指導(dǎo)臨床合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥品 PNS［廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司］，依據(jù)國家藥品標(biāo)準(zhǔn) WS-10460-(ZD-0460)-2002-2011Z檢驗(yàn)合格;DMEM和血清(FBS)(Hyclone);胰酶(Sigma);MTS試劑盒(Promega);LDH試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司);PBS(北京凱欣杰生物技術(shù)有限公司);RNApure超純總RNA快速提取試劑盒(博邁德生物);Trans ScriptTMOne-Step RT-PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司);Fast SYBR@Green Master Mix(Applied Biosystems)，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(NAPCO 5410);超凈工作臺(tái)(北京長城空氣凈化設(shè)備公司);倒置顯微鏡(Nikon 120型);Victor X5酶標(biāo)儀(Perkin Elmer)PCR儀(Gene Amp 2400);核酸蛋白分析儀 (Beckman DU640);StepOne PlusTMReal Time PCR(Applied Biosystems)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞株來源于大鼠胚胎期心臟組織(購自北京協(xié)和細(xì)胞庫)，在37℃、5%CO2的條件下，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基中，融合率為80% ～90%時(shí)，按1∶3的比例傳代。

1.4 PNS 母液配制(200 g·L－1)［10］精確稱取2.000 g的PNS粉末，加入5 ml的去離子水，緩慢攪拌使其溶解，再加去離子水定容至10 ml，攪拌使其充分溶解;用0.22 μm孔徑的微孔濾器過濾除菌;分裝至1.5 ml EP管，4℃冰箱保存。

1.5 MTS法檢測(cè)H9c2細(xì)胞活性 用DMEM培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞以2×104個(gè)/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板(空白孔不種細(xì)胞)，200 μl/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng) 24 h;實(shí)驗(yàn)分為空白組，PNS組(濃度依次為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 g·L－1)和陰性對(duì)照組，培養(yǎng)48 h;每孔加MTS液8 μl，繼續(xù)孵育4 h;用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的光密度值(OD);按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(IC)/%=(實(shí)驗(yàn)組OD值－空白組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值－空白組OD值)×100%

1.6 乳酸脫氫酶比色法(LDH)檢測(cè)H9c2細(xì)胞損傷 對(duì)數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞以2×104個(gè)/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板(空白孔不種細(xì)胞)，200 μl/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h;實(shí)驗(yàn)分組如上，培養(yǎng)48 h后，按照LDH試劑盒操作說明進(jìn)行試驗(yàn)，按以下公式計(jì)算細(xì)胞的損傷。

細(xì)胞LDH釋放率/%=細(xì)胞培養(yǎng)基中測(cè)定的酶活力單位/(細(xì)胞裂解液測(cè)定的酶活力單位+細(xì)胞培養(yǎng)基測(cè)定的酶活力單位)×100%

1.7 Real Time PCR測(cè)定H9c2細(xì)胞CYP450 mRNA水平影響 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，PNS組(濃度依次為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5 g·L－1)接種 6孔板中，給藥48 h后取各處理組H9c2細(xì)胞，按試劑盒說明提取心肌細(xì)胞總RNA，電泳分析表明18S和28S條帶清晰可見，A260/A280比值在 1.7～2.0，總RNA片段完整未降解可用。取 2 μg RNA按照TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，42℃ 30 min;85℃ 5 min。用 ABI StepOne PlusTMReal Time PCR進(jìn)行 PCR反應(yīng)，取2.0 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，加入上下游引物 20 μmol· L－1各 0.5 μl，F(xiàn)ast SYBR@Green Master Mix 10 μl，補(bǔ)充 Rase-free water 至 20 μl。反應(yīng)參數(shù):95℃ 20 s預(yù)變性，95℃ 3 s變性，60℃ 30 s退火，共40個(gè)循環(huán)。每次擴(kuò)增設(shè)置β-actin內(nèi)參照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)定量分析，用2－(△△Ct)方法分析。特異性引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers sequence used in Real Time PCR analy

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)重復(fù)3次，每次設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉ±s表示，采用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTS法檢測(cè)H9c2細(xì)胞活性 以PNS(濃度依次為 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 g·L－1)處理H9c2細(xì)胞48 h以后，測(cè)定各處理組細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示隨著三七總皂苷濃度的升高，細(xì)胞的存活率逐漸下降。低濃度的PNS對(duì)細(xì)胞的存活率沒有影響(如0.3125、0.625 g·L－1)。用Origin8.0 軟件擬合計(jì)算IC50(5.28±0.08)g·L－1(Fig 1)。

2.2 乳酸脫氫酶比色法(LDH)檢測(cè)H9c2細(xì)胞損傷 對(duì)各處理組細(xì)胞的LDH進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示以PNS處理H9c2細(xì)胞48h后，隨著PNS濃度的升高，乳酸脫氫酶的釋放率逐漸增大，與空白組比較，5、10、20 g·L－1組的 LDH 釋放率明顯增高(P＜0.01)，而 0.3125、0.625、1.25 g·L－1組的 LDH 釋放率沒有變化(Fig 2)。

Fig 1Effect of PNS on cell viability of H9c2 cells(ˉ±s，n=5)

Fig 2Effect of PNS on LDH release rate of H9c2 cells(ˉ±s，n=5)

2.3 PNS對(duì)H9c2細(xì)胞P450酶 mRNA表達(dá)的影響

2.3.1 PNS對(duì) H9c2細(xì)胞 CYP2C11和 CYP2J3亞型mRNA水平的影響 PNS對(duì)H9c2細(xì)胞CYP450酶Ⅱ家族mRNA表達(dá)的影響如Fig 3所示，與空白組比較，PNS對(duì)CYP2C11有下調(diào)趨勢(shì)(P＜0.05或P＜0.01)，而對(duì)CYP2J3有上調(diào)作用，且作用比較明顯(P＜0.01)。

2.3.2 PNS對(duì) H9c2細(xì)胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4A3、CYP4F1、CYP4F4 和 CYP4F5 亞型mRNA水平的影響 如Fig 4所示，PNS對(duì)H9c2細(xì)胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4F1和CYP4F5有上調(diào)趨勢(shì)(P＜0.01)，并且有一定的濃度依賴性。PNS對(duì)CYP4A3和CYP4F4，在低濃度時(shí)有下調(diào)作用(P＜0.05或P＜0.01)，而在最大濃度時(shí)，對(duì)這兩個(gè)亞型有一定的上調(diào)作用(P＜0.01)。

3 討論

Fig 3Effect of PNS on CYP2C11 and CYP2J3 gene expression of H9c2 cellsˉ±s，n=3)

細(xì)胞色素P450(CYPs)酶是混合功能氧化酶系，多表達(dá)于肝臟，人體內(nèi)約有75%的藥物通過CYP450代謝［11］。EETs具有抗炎，抑制平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，調(diào)節(jié)血管張力，促纖溶，抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用，在心腦血管中有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，主要有CYP2C11和 CYP2J3參與［12］。20-HETE在大鼠中主要由CYP450酶4家族代謝，這是一種強(qiáng)有力的縮血管物質(zhì)，對(duì)血壓調(diào)節(jié)有重要影響，主要有CYP4A和4F參與［13］。因此本文從心臟的主要藥物代謝酶為研究對(duì)象，研究PNS對(duì)上述CYP亞型表達(dá)的影響，旨在探討PNS對(duì)心血管藥理作用新的可能機(jī)制。

Fig 4Effect of PNS on CYP4A1，CYP4A2，CYP4A3，CYP4F1，CYP4F4 and CYP4F5 gene expression of H9c2 cells(ˉ±s，n=3)

MTS的測(cè)定結(jié)果可以反映細(xì)胞的存活程度。細(xì)胞受到損傷時(shí)，激活一系列的酶促反應(yīng)造成細(xì)胞內(nèi)LDH大量外釋，并且誘導(dǎo)細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。通過PNS處理H9c2細(xì)胞48 h后，MTS結(jié)果表明隨著PNS濃度的增大，細(xì)胞的存活率逐漸降低，并且呈濃度依賴性，低濃度對(duì)細(xì)胞的存活率沒有影響(如 0.3125、0.625 g·L－1);LDH 的釋放率隨著濃度的升高而逐漸增大，0.3125、0.625、1.25 g·L－1組的LDH釋放率沒有變化。提示PNS在高濃度時(shí)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞有一定的損傷。PNS對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞有一定的抑制作用，并呈劑量依賴性［14］。有研究顯示PNS在治療劑量下對(duì)肝臟損傷有保護(hù)作用，大劑量(150 mg·kg－1)對(duì)大鼠有肝腎毒性，在150 mg·kg－1以上時(shí)對(duì)心臟功能具有毒性效應(yīng)［15－16］。結(jié)合本次研究結(jié)果，提示臨床應(yīng)用此類藥物時(shí)應(yīng)注意劑量。

CYP2J2/3主要表達(dá)于心臟，且主要合成具有心臟保護(hù)作用的EETs，而EETs有擴(kuò)張血管的作用。大鼠心臟CYP2J3與人類心臟CYP2J2具有70%的同源性。Bhatnagar［17］研究發(fā)現(xiàn) CYP2J對(duì)心臟表現(xiàn)為保護(hù)作用，而CYP2C則表現(xiàn)為加重?fù)p傷，提出CYP450不同亞型可能因產(chǎn)生氧自由基不同，而表現(xiàn)為加重或拮抗心肌缺血/再灌注損傷。PNS各濃度對(duì)CYP2C11有下調(diào)趨勢(shì)，而對(duì)CYP2J3有上調(diào)作用，提示PNS有一定的保護(hù)心臟，擴(kuò)張血管的作用。CYP450酶4家族羥化酶代謝花生四烯酸產(chǎn)生20-HETE，這是一種強(qiáng)有力的縮血管物質(zhì)。PNS各濃度對(duì) H9c2細(xì)胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4F1和CYP4F5有上調(diào)趨勢(shì)，而對(duì) CYP4A3和CYP4F4在低濃度時(shí)有下調(diào)作用，而在最大濃度時(shí)(5 g·L－1)，對(duì)這兩個(gè)亞型有一定的上調(diào)作用，這可能是高濃度對(duì)細(xì)胞的影響的結(jié)果。

PNS作為臨床用血栓通的主要成份，本研究結(jié)果顯示高濃度的PNS可能會(huì)有一定的毒性。同時(shí)PNS對(duì)CYP450酶不同的亞型有不同程度的誘導(dǎo)或者抑制作用，提示PNS對(duì)心臟和血管有一定的保護(hù)作用。因此使用PNS時(shí)應(yīng)注意用藥劑量，使其發(fā)揮療效而盡量減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)在臨床應(yīng)用時(shí)注意用藥劑量。

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