肖 艷，牛榮麗

(華僑大學(xué)分子藥物研究院，福建廈門(mén)361021)

海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最主要的初級(jí)生產(chǎn)者，它具有種類(lèi)多、數(shù)量大、繁殖快等特點(diǎn)，在保健食品、藥物、化妝品、生物農(nóng)藥、污水治理等方面有廣泛的應(yīng)用，逐步成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)［1］。近年來(lái)從海洋微藻中分離提取出多種生物活性物質(zhì)［2］，如從小球藻中提取得到的耐高溫球蛋白和單半乳糖基二?；蛔C明有抗腫瘤作用。對(duì)海洋微藻中的抗菌活性物質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，部分脂肪酸及其酯類(lèi)衍生物有抗菌活性［3-6］，如EPA(二十碳五烯酸)對(duì)食品腐敗菌有一定的抗菌活性［7］，但是EPA甲酯的抗菌活性幾乎無(wú)報(bào)道。本文利用多種提取分離方法，從海洋微藻小球藻中得到EPA甲酯，并將得到的EPA甲酯成分與其他脂肪酸甲酯進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)其抗菌活性最好，并對(duì)多種菌表現(xiàn)出抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海水小球藻粉 盤(pán)錦光合蟹業(yè)有限公司提供;金黃色葡萄球菌(ATCC6538P)、大腸桿菌(ATCC8739) 實(shí)驗(yàn)室凍存菌種;枯草芽孢桿菌(10275)、銅綠假單胞菌(10204) 購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理中心;瓊脂、酵母提取物、蛋白胨 生化試劑;氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、尿素 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純;EPA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99% 美國(guó)NU-CHEK公司。

GC-6890色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;GC-MSQP2010聯(lián)用儀 日本島津公司;高壓蒸汽滅菌鍋ZEALWAY;MAXO400搖床 Thermo scientific;HPX-9082 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-IFD潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)有限公司。

1.2 粗脂的提取

取小球藻粉 10g，用氯仿∶甲醇(2∶1，V/V)混合液75mL，于4℃冰箱中浸提16h，過(guò)濾，回收溶劑得到浸膏。浸膏中加入50mL 0.88%NaCl水溶液，于分液漏斗中搖勻靜置分層，用圓底燒瓶收集下層有機(jī)相，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到粗脂。

1.3 多不飽和脂肪酸(PUFA)的分離

采用皂化-尿素包合的方法，取上步制得的粗脂，加入40mL 1mol/L NaOH-乙醇，在60℃水浴下皂化1h，室溫冷卻，過(guò)濾除皂，用6mol/L HCl調(diào)至pH至1～2，將得到的皂化液加入20mL的正己烷萃取三次，靜置分層，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到游離的脂肪酸。取游離脂肪酸，按脂肪酸∶尿素∶甲醇 =1∶3∶9(W/W/V)比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。尿素與甲醇于70℃封塞旋轉(zhuǎn)溶解，然后迅速加入脂肪酸，冷卻至室溫后，于4℃下包合24h。將上述冷卻結(jié)束后的尿包樣品，用布氏漏斗迅速抽濾，收集濾液移入分液漏斗中，加入30mL去離子水，分別用20mL的正己烷萃取三次，靜置分層，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到多不飽和脂肪酸。

1.4 脂肪酸甲酯的制備

將制得的脂肪酸放入250mL圓底燒瓶中，再加30mL 3N鹽酸-甲醇充分混合，加入幾粒沸石，連接回流裝置，在充氮?dú)獾臈l件下，70℃加熱回流1h;然后取出冷卻，移入分液漏斗，加入20mL蒸餾水，用10mL正己烷萃取，重復(fù)2次，合并有機(jī)相，加無(wú)水Na2SO4脫水后抽濾，然后40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮，殘液為其脂肪酸甲酯，于4℃冰箱放置，進(jìn)樣前用正己烷稀釋到100mg/kg左右，精密量取1μL注入氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，記錄色譜圖，按峰面積歸一化法計(jì)算各個(gè)脂肪酸的含量。

1.5 多不飽和脂肪酸甲酯的純化

稱取1g上述脂肪酸甲酯粗品，加入硝酸銀-硅膠層析柱中［8］，依次用 1%、5%、10%、16%、22%、26%、30%丙酮-正己烷混合溶液兩個(gè)柱體積進(jìn)行洗脫，控制洗脫流速1mL/min，并每10mL收集1次洗脫液，經(jīng)TLC分析，相同部分合并，再經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用色譜測(cè)定EPA甲酯的含量。

1.6 GC及GC－MS條件

GC條件:Agilent 19091N-113毛細(xì)管柱(30m×0.32mm ×0.25μm)，進(jìn)樣口溫度 250℃，壓力 10.19psi，分流比 40∶1，程序升溫，從 150℃開(kāi)始保持 1min，以15℃/min升至200℃，再以2℃/min升至230℃，保持0min。檢測(cè)器溫度275℃。H2流量4.5mL/min，空氣流量400mL/min，N2流量1.5 mL/min。

GC-MS條件:Rtx-Wax毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm);載氣:高純氦氣;測(cè)定條件:面積歸一化法，進(jìn)樣口溫度220℃，程序升溫，從150℃開(kāi)始保持1min，以15℃/min升至200℃，再以2℃/min升至230℃，保持6min。壓力為72.0kpa，分流比為20∶1。質(zhì)譜條件:EI離子源，離子源溫度為220℃，接口溫度250℃。檢測(cè)器電壓1.2kv，溶劑延遲2min，掃描范圍45～350。

1.7 抗菌實(shí)驗(yàn)

采用圓形紙片［9］定性實(shí)驗(yàn)測(cè)得各脂肪酸甲酯的抑菌圈和試管稀釋法［10］定量實(shí)驗(yàn)測(cè)得最小抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC及GC－MS結(jié)果

用氣相色譜進(jìn)行定性分析。如圖1所示EPA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的Rf為10.368。將得到的粗脂、多不飽和脂肪酸及EPA分別進(jìn)行甲酯化后，進(jìn)行氣相分析，如圖2～圖4所示。經(jīng)過(guò)各步的提取分離純化以后，EPA甲酯的純度在不斷增加，最后得到EPA甲酯的純度可達(dá)到98.2%。

圖1 EPA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of EPA methyl ester

圖2 粗脂甲酯氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of fatty acid methyl ester

圖3 尿包后多不飽和脂肪酸甲酯氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of Polyunsaturated fatty acid methyl ester

圖4 過(guò)柱后EPA純度為98.2%氣相色譜圖Fig.4 After through the column the purity of EPA methyl ester is 98.2%

用氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，對(duì)所得到的3種脂肪酸甲酯進(jìn)行成分和含量分析，如表1所示。粗脂甲酯中含有9種脂肪酸甲酯，其中十六烷酸的含量最高，其次是十六烷烯酸。經(jīng)過(guò)尿素包合處理后，多不飽和脂肪酸的含量增多，不飽和脂肪酸的含量降低，其中EPA甲酯的含量達(dá)到30.20%。

表1 各步中脂肪酸組成及相對(duì)含量(%)Table 1 Composition and relative content of fatty acid on each step experiment(%)

2.2 抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖5可以看出，3種脂肪酸甲酯對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌沒(méi)有明顯的抑菌圈，對(duì)枯草桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌圈。粗脂甲酯的抑菌效果要弱于PUFA甲酯和EPA甲酯的抑菌效果。這與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的海藻提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果要強(qiáng)于革蘭氏陰性菌相似。

圖5 3種脂肪酸甲酯分別對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.5 Effect of three fatty acid methyl esters on viability of Escherichia coli，Pseudomonas aeruginos，Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus

由表2可以看出，粗脂甲酯和PUFA甲酯對(duì)枯草桿菌的抑菌效果最好，MIC值分別為3.594mg/mL和0.831mg/mL。EPA甲酯對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC為0.692mg/mL。

3 結(jié)論

3.1 海水小球藻是一種天然保健食品，經(jīng)研究測(cè)定，其含有蛋白質(zhì)50%，脂肪酸15%～20%。EPA是一種人體內(nèi)不能合成的必需脂肪酸，在人體中具有重要的生物學(xué)意義。文中采用了GC-MS技術(shù)對(duì)小球藻中脂肪酸的種類(lèi)和含量進(jìn)行了測(cè)定，并通過(guò)提取分離純化得到EPA甲酯的純度為98.20%。為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表2 脂肪酸甲酯的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果(mg/mL)Table 2 Antibacterial activity of fatty acid methyl esters(mg/mL)

3.2 定性和定量的抗菌實(shí)驗(yàn)表明，脂肪酸甲酯成分對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌具有一定的抑制和殺滅作用，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的效果要好于革蘭氏陰性菌。脂肪酸甲酯成分中EPA甲酯的抑菌效果要好于粗脂甲酯和PUFA甲酯，這說(shuō)明純度越高的EPA甲酯抑菌效果越好。因此，今后可以選用與EPA甲酯相似的其他多不飽和脂肪酸甲酯進(jìn)行抗菌研究。

［1］李冰，徐濤，蔡敬民.海洋微生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(23):13934-13978.

［2］胡蓓娟，王雪青，姚領(lǐng)，等.從微藻中分離提取生物活性物質(zhì)［J］.食品科學(xué)，2006，27(7):264-269.

［3］Naviner M，Berge J P，Du Rand P，et al.Antibacterial activity of the marine diatom Skeleonema costatum against aquacultural pathogens［J］.Aquaculture，1999，174:15-24.

［4］葉錦林，王明茲.紫球藻及其多糖抗菌性能初探［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2004，33(3):31-33.

［5］Desbois A P，Mearns-Spragg A，Smith V J.A fatty acid from the diatom phaeodactylum tricornutum is antibacterial against diverse bacteria including multi-resistantStaphylococcus aureus(MRSA)［J］.Mar Biotechnol，2009(11):45-52.

［6］Huang C B，George B，Ebersole J L.Antimicrobial activity of n-6，n-7 and n-9 fatty acids and their esters for oral microorganisms［J］.Arghives of oral biology，2010(55):555-560.

［7］Shin SY，Bajpai V K，Kim H R，et al.Antibacterial activity of eicosapentaenoic acid(EPA)against foodborne and food spoilage microorganisms［J］.LWT，2007(40):1515-1519.

［8］王嵩.海藻油中分離純化多烯脂肪酸的研究［D］.天津:天津大學(xué)，2008.

［9］江紅霞，鄭怡.8種微藻抗菌活性研究［J］.福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2002，18(2):117-120.

［10］王文風(fēng)，梅英杰，徐玲，等.10-HDA抗菌實(shí)驗(yàn)的初步研究［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28(10):36-38.

［11］陳灼華，鄭怡，莊惠如.10種紅藻和褐藻抗細(xì)菌抗真菌活性的研究［J］.福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1994，10(4):75-79.