周必洪，傅玉輝，閆 虎，陳寶軍，張慶，張子怡，王藝如，蘇友新

（福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122）

課題組前期研究［1-4］發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)寧顆粒具有較好抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛等作用，能有效控制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的癥狀，但其具體作用環(huán)節(jié)尚不明確。近年來(lái)研究表明：急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病可能與關(guān)節(jié)滑膜TLR-2、4、MyD88 mRNA的高表達(dá)、關(guān)節(jié)滑液中 TNF-α、IL-1β的增多及大量中性粒細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)腔有關(guān)。課題組擬以急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠為模型，觀察痛風(fēng)寧顆粒對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)滑液TNF-α、IL-1β含量及滑膜組織中TLR-2、4，MyD88 mRNA表達(dá)的影響，以進(jìn)一步闡明痛風(fēng)寧顆?？寡住㈡?zhèn)痛作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重（200±15）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005，合格證號(hào)：0073141］，委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)和飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及藥物 白細(xì)胞介素-1β（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)：20091225、2009122）；微晶型尿酸鈉（Sigma-aldrich 公司，批號(hào)：108K5309）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR Master Mix（Fermentas公司，批號(hào)：K1622、K0171）；100bp Ladder（百泰克公司，批號(hào)：PR3001）；痛風(fēng)寧顆粒：每克含生藥3.2 g（福州辰星藥業(yè)有限公司提供，中試產(chǎn)品批號(hào)：101024）；秋水仙堿：0.5 mg／片（云南省玉溪望子龍生物制藥有限公司，批號(hào)：20090702）。

1.3 主要設(shè)備 PYX-DHS恒溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；CUT4060石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；BH-2光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；101A-2真空干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；PE9600基因擴(kuò)增儀（香港PERKIN ELMER公司）；梯度PCR儀（英國(guó)GENE TECHNOLOGIES 公司）；FJ2008PS γ 放射免疫計(jì)數(shù)器（西安二六二廠）；Allegra 64R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥品制備

1.4.1.1 尿酸鈉溶液的制備 電子天平稱(chēng)取尿酸鈉晶體2.5 g，高溫高壓后，加入無(wú)菌生理鹽水至100 mL，制成 25 mg／mL的尿酸鈉懸濁液，4℃保存，用前搖勻。

1.4.1.2 干預(yù)藥物制備 成人（60 kg）每日痛風(fēng)寧顆粒、秋水仙堿常用量分別為27 g、3 mg，根據(jù)人與大鼠用量關(guān)系［5］換算得出大鼠每日以上2種干預(yù)藥物的用量分別為 2.93 g／kg、0.325 mg／kg。 依據(jù)上述用藥量計(jì)算出每只大鼠的用藥量，加入2 mL蒸餾水溶解，制成混懸液，4℃保存，用前搖勻。

1.4.2 動(dòng)物分組及造模 用隨機(jī)數(shù)字表法把適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后的36只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠分成正常組、模型組、痛風(fēng)寧顆粒組、秋水仙堿組共4組。參照Coderre造模方法［6］，固定板固定大鼠，以右膝關(guān)節(jié)為中心，常規(guī)消毒，以右膝外側(cè)膝眼為進(jìn)針點(diǎn)，向每個(gè)正常組大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.2 mL生理鹽水，其余3組大鼠以同樣的方法分別注入0.2 mL 2.5%尿酸鈉懸濁液。

1.4.3 藥物干預(yù) 造模1 h后，痛風(fēng)寧顆粒組、秋水仙堿組大鼠根據(jù)體重分別使用相應(yīng)藥物混懸液2 mL灌胃，正常組、模型組大鼠分別以2 mL生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)3 d。

1.4.4 標(biāo)本采集 末次灌胃1 h后，各組實(shí)驗(yàn)大鼠分別用10%水合氯醛以300 mg／kg的劑量腹腔注射麻醉。麻醉成功后，以大鼠右膝關(guān)節(jié)為中心，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，戴無(wú)菌手套，切開(kāi)右膝關(guān)節(jié)囊，關(guān)節(jié)腔用1 mL生理鹽水沖洗，收集沖洗液，取1滴于載玻片上涂片，福爾馬林溶液固定；切取關(guān)節(jié)囊，固定于4%中性甲醛固定液。

1.4.5 關(guān)節(jié)液HE染色光鏡下中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 將固定的載玻片進(jìn)行HE染色，嚴(yán)格按HE染色試劑盒步驟操作，400倍光鏡下取5個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，取均值。

1.4.6 滑膜組織HE染色光鏡下觀察 取出固定于4%中性甲醛液中的關(guān)節(jié)囊，沖洗后常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制作成蠟塊后，切片、脫蠟、復(fù)水、HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)的變化。

1.4.7 關(guān)節(jié)液細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β檢測(cè) 嚴(yán)格按照放射免疫試劑盒步驟操作，檢測(cè)各組大鼠關(guān)節(jié)沖洗液中TNF-α、IL-1β的含量。

1.4.8 滑膜組織中TLR-2、4及MyD88 mRNA的表達(dá)檢測(cè) ① 總RNA的提?。翰捎肨rizol法提取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒步驟操作。②RNA純度及完整性檢測(cè)：取2 μL總RNA稀釋50倍后加入紫外分光光度計(jì)中，測(cè)定樣品在260 nm和280 nm的吸光值，計(jì)算出OD 260／OD 280值， 按 1 OD＝40 μg／mL RNA 計(jì)算 RNA 的純度。③cDNA的制備：在PCR管中配制反應(yīng)體系，1 μg RNA的體積根據(jù)所得的OD值計(jì)算得出，用無(wú)RNA酶的水調(diào)整體系至20 μL；在PCR儀上設(shè)置反應(yīng)條件，30℃ 5 min、42℃ 60 min、95℃ 5 min、70℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后保存于-20℃冰箱。④RT-PCR反應(yīng)：引物的設(shè)計(jì)，由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司合成Pubmed上檢索的TLR-2、4及MyD88完整外顯子序列（見(jiàn)表1）；反應(yīng)體系的配置：在RT-PCR反應(yīng)專(zhuān)用八聯(lián)管中進(jìn)行，每個(gè)樣本重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，并做一個(gè)陰性對(duì)照；反應(yīng)條件，94℃ 3 min、94℃ 30 s、X℃30 s（TLR255℃、TLR455℃、MyD8855℃）、72℃ 30 s、35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，4℃ 保存。 在GS-1 PCR儀工作程序上設(shè)定三步法檢測(cè)。

表1 引物設(shè)計(jì)

2 結(jié) 果

2.1 模型鑒定 造模前正常組、模型組、痛風(fēng)寧顆粒組大鼠皮毛光澤色白，活潑好動(dòng)，飲食正常；造模1 h后，除空白組外，其余3組大鼠均出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫，局部皮膚溫度升高，活動(dòng)減少，舔足，飲食量減少等現(xiàn)象。圖1、表2顯示除正常組外，其余各組大鼠關(guān)節(jié)液中性粒細(xì)胞數(shù)均升高，模型組較正常組有非常顯著性差異（P＜0.01），表明急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠造模成功。

2.2 關(guān)節(jié)液中性細(xì)胞HE染色光鏡下計(jì)數(shù) 見(jiàn)圖1、表 2。

圖1 大鼠關(guān)節(jié)液HE光鏡下染色圖（×400）

表2 各組關(guān)節(jié)液中性粒細(xì)胞含量比較

2.3 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織HE染色光鏡下觀察見(jiàn)圖2。圖2顯示：正常組滑膜組織可見(jiàn)極少中性粒細(xì)胞，滑膜細(xì)胞排列規(guī)則，無(wú)水腫；模型組滑膜組織可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞，滑膜細(xì)胞排列不規(guī)則，有明顯水腫；痛風(fēng)寧顆粒組及秋水仙堿組滑膜組織可見(jiàn)少量的中性粒細(xì)胞，滑膜細(xì)胞排列較規(guī)則，輕度水腫。

圖2 大鼠滑膜HE染色圖（×200）

2.4 關(guān)節(jié)液細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表3。

表3 各組關(guān)節(jié)液中TNF-a、IL-1β含量比較

2.5 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR-2、4及MyD88 mRNA表達(dá)檢測(cè)

2.5.1 RNA純度及完整性鑒定 經(jīng)測(cè)定各組抽提的總RNA結(jié)果均滿足OD260／OD280值在1.8～2.0范圍及1%瓊脂糖凝膠電泳中28S和18S條帶清晰的要求。表明提取的總RNA純度高、完整性好。

2.5.2 各組TLR-2、4及MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的RT-PCR結(jié)果 見(jiàn)表4。

3 討 論

Toll樣受體（toll-like receptor，TLRs）中的 TLR-2、4和其重要的銜接蛋白髓樣分化因子（MyD88）參與了痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和消退過(guò)程［7-8］。靜息狀態(tài)下，TLRs受體與MyD88結(jié)合成復(fù)合物，未受刺激時(shí)處于無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)TLRs受體與病原相關(guān)分子結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化，胞質(zhì)中的TLR結(jié)構(gòu)域與MyD88的羧基末端相互作用，MyD88就開(kāi)始募集下游絲／蘇氨酸蛋白激酶IRAK1和IRAK2，導(dǎo)致IRAK自身磷酸化；磷酸化的IRAK脫離MyD88與TRAF6（TNFR-associated factor）結(jié)合，活化的 TRAF6引起 MAP3K（mitogen-activated protein kinase）家族成員 NIK（NF-κβ-inducing kinase）活化；此后又激活 κβ 激酶（κβ kinases，IKKs），導(dǎo)致 κβ 的泛素化而從 κβ／NF-κβ 復(fù)合物釋放；NF-κβ 由此活化轉(zhuǎn)位進(jìn)核，導(dǎo)致一系列特定基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生原發(fā)性致炎因子如IL-1β、TNF-α等，完成炎癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程［9-10］。其中與痛風(fēng)關(guān)系密切的細(xì)胞因子有IL-1β、TNF-α。IL-1β能激活I(lǐng)L-1受體，致使其它炎癥調(diào)節(jié)因子及相關(guān)趨化因子發(fā)揮作用，引起中性粒細(xì)胞進(jìn)入并聚集于尿酸鹽沉積部位；此又可增強(qiáng)IL-1與其受體結(jié)合，引起更多中性粒細(xì)胞匯聚于尿酸鹽沉積部位；如此正反饋調(diào)節(jié)，促使急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥產(chǎn)生和發(fā)展。而TNF-α能激活NF-κB信號(hào)通路，促使IL-1、IL-8等細(xì)胞因子分泌及中性粒細(xì)胞出現(xiàn)吞噬活性并釋放氧自由基和蛋白水解酶，導(dǎo)致尿酸鹽沉積處出現(xiàn)充血、水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維素滲出，并呈不斷加重［11］。因此，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病與TLRs／MyD88信號(hào)通路的激活，細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α等的升高及中性粒細(xì)胞的聚集等因素密切相關(guān)。

表4 各組TLR-2、4及MyD88 mRNA表達(dá)情況比較

本實(shí)驗(yàn)觀察到：痛風(fēng)寧顆粒能夠顯著降低大鼠病變關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液中中性粒細(xì)胞的含量及細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生，這與課題組前期利用兔子進(jìn)行觀察的結(jié)果一致［12］，表明痛風(fēng)寧顆粒具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛作用；痛風(fēng)寧顆粒能夠顯著抑制TLR-2、TLR-4及MyD88 mRNA表達(dá)，正常組與模型組比較具有顯著性差異（P＜0.05），提示痛風(fēng)寧顆粒對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的抗炎、鎮(zhèn)痛作用可能是通過(guò)抑制TLR-2、4及 MyD88基因的激活，進(jìn)而減少 TNF-α、IL-1β的生成有關(guān)。本研究還顯示：秋水仙堿可以抑制TLR-2、TLR-4及MyD88 mRNA表達(dá)，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05），但其結(jié)果顯著高于正常組及痛風(fēng)寧顆粒組，這表明秋水仙堿抗炎、鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制與痛風(fēng)寧顆粒作用機(jī)制有所不同，需要進(jìn)一步研究。

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