★ 李錦文 陳來 羅小泉＊＊ (. 江西省貴溪市人民醫(yī)院 貴溪335400;. 江西中醫(yī)學院 南昌

330009)

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)系指在缺血性、出血性及急慢性缺血缺氧性腦血管疾病引起的腦組織損害基礎上產生的以高級神經認知功能障礙為主的一組臨床綜合征［1］。是我國最常見的老年癡呆類型之一。由于VD 嚴重危害患者的健康，同時給家庭和社會帶來巨大經濟壓力和負擔，因此，關于VD 的發(fā)病機理與治療藥物的研究日益受到世界各國政府和學者的高度重視［2－3］。枳殼醇提脂溶性成分(含川陳皮素、橘皮內酯、橘紅素和葡萄內酯)。

大量文獻報道橘紅素，川陳皮素等具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、預防心血管疾病和神經保護作用［4－9］，可以抑制腫瘤壞死因子TNF－α 表達;同時文獻也報道葡萄內酯是一種AchE 抑制劑［10－11］并對神經細胞具有保護作用［7－11］;但對枳殼醇提脂溶性成分與葡萄內酯對血管性癡呆模型鼠的實驗研究還未見報道。本研究觀察枳殼醇提脂溶性成分與葡萄內酯對結扎雙側頸總動脈大鼠學習記憶改善的影響及對生化指標的改變，探討枳殼醇提脂溶性成分與葡萄內酯對血管性癡呆保護作用的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠130 只，體重200 ±20g(湖南斯萊克實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(湘)2011 －0003，合格證號43004700000965)。

1.2 藥品與試劑

枳殼醇提物脂溶性部位(含川陳皮素、橘皮內酯、橘紅素和葡萄內酯);安理申(批號:071121A)衛(wèi)村(中國)藥業(yè)有限公司制造;MDA、SOD、AchE 測定試劑盒(批號均為:20100507)購于江蘇省南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

UV － 1600 型分光光度計(北京瑞利公司);Morris 水迷宮硬件與視頻分析系統(tǒng)(北京天鳴宏遠科技發(fā)展有限公司);高速離心機(美國Sigma 公司)。

2 方法

2.1 VD 動物模型制備

采用雙側頸總動脈永久性結扎模擬血管性癡呆。大鼠術前禁食12 小時、禁水4 小時。用10%水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸前部備皮、消毒后，沿頸正中切開皮膚、肌肉，分離出雙側頸總動脈，套以“0”號絲線，分別結扎雙側頸總動脈的遠近端，確保阻斷動脈血流。術中大鼠體溫保持在(36.5 ±0.5)℃，以防止低溫對腦缺血保護作用。術后用青霉素鈉水溶液局部涂敷，預防感染。假手術組僅進行頸前切開、分離，不結扎頸總動脈，其它同模型組操作。

2.2 動物分組及給藥

選擇96 只建模成功(雙側頸總動脈結扎造模后無肢體殘疾的存活的大鼠)隨機分成8 組(模型組、陽性藥組、醇提物高中低組、葡萄內酯高中低組)，每組12 只，另假手術組12 只。分別灌胃安理申混懸液0.5mL/100g(相當于成人每日量的5mg/人·天)，1 次/天;枳殼醇提脂溶性浸膏3 組各0.5mL/100g(小、中、高劑量組分別為1g 浸膏/天、3g浸膏/天、6g 浸膏/天;葡萄內酯3 組各0.5mL/100g(小、中、高劑量組分別為10mg/天、20mg/天、60mg/天;模型組與假手術組分別灌胃等體積的生理鹽水。共35 天。

2.3 動物行為學測試

采用Morris 水迷宮實驗方法測試大鼠的學習記憶能力。Morris 水迷宮的裝置由一不銹鋼圓形水池通過攝像機與電腦連接所組成。圓形不銹鋼直徑160cm、高50cm 的圓形水池，水池內壁被漆為黑色，池內水深25cm，水溫保持在(22 ±2)℃，房間內光照恒定，無光線直射在水池內。池壁上以四個等距離點將水池分為四個象限，在目標象限(設為第三象限)內距離池壁35cm 處放有一個直徑為12cm、高23cm 的圓形黑色站臺，站臺位于水面下2cm。池壁內側貼有不同形狀的標記物。迷宮上方安置連接顯示系統(tǒng)的攝像機，同步記錄大鼠運動軌跡。采用北京天鳴宏遠科技發(fā)展有限公司研制開發(fā)的Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)進行信息處理。進行定位航行實驗和空間探索實驗，共歷時6 天。

2.3.1 定位航行實驗

每天2 次，歷時5 天，跟蹤記錄大鼠游泳軌跡。將大鼠面向池壁，分別從4 個入水點下水，記錄在2分鐘內尋找到平臺的時間(稱逃避潛伏期)，如果在2 分鐘以上未找到平臺，潛伏期記為120 秒。訓練時實驗者可以幫助大鼠找到平臺，并停留10 秒。試驗完后將大鼠放回鼠籠中。在第5 天，選取離平臺最遠象限作為入水點，此時大鼠的逃避潛伏期作為評價大鼠學習記憶能力的指標。

2.3.2 空間探索試驗

定位航行試驗完成后(第6 天)撤去平臺，選擇離原平臺最遠的象限為大鼠入水點，記錄大鼠的游泳軌跡和時間，并測定在2 分鐘內第1 次跨越原平臺象限游泳的時間及頻率［次數/(2 分)］作為評價大鼠學習記憶能力的指標。

2.4 組織形態(tài)學實驗

Morris 水迷宮實驗結束后，每組隨機選取2 只大鼠，10%水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉。用0.9%的生理鹽水和4%多聚甲醛的磷酸緩沖液，灌注固定，逐級酒精脫水、透明、浸蠟、包埋，進行常規(guī)石蠟包埋切片，厚5μm，蘇木精和伊紅染色，低倍鏡(10 ×10)確定海馬區(qū)位置，高倍鏡(10 ×40)觀察海馬CA1 區(qū)錐體層細胞的形態(tài)，在光鏡下拍照(見圖1)。

2.5 AchE、SOD 活性和MDA 含量測定

Morris 水迷宮實驗結束后，將各組大鼠處死，取腦稱重后加9 倍重量冰生理鹽水制備10%勻漿，離心10 －15 分鐘取上清。嚴格按試劑盒說明進行AchE、SOD 活性和MDA 含量測定。

2.6 統(tǒng)計學方法

所有的數據以(ˉx±s)表示，采用SPSS11.5 進行方差分析和多組間均數比較，P ＜0.05 為差異有顯著意義，P ＜0.01 為差異有極顯著意義。

3 結果

3.1 枳殼醇提物脂溶性部位與葡萄內酯增強VD大鼠學習記憶能力

3.1.1 定位航行實驗

如表1 所示，葡萄內酯小、中、高劑量組和浸膏高劑量組大鼠逃避潛伏期則較模型組明顯縮短，具有顯著性差異(P ＜0.05)。陽性藥對照組和浸膏小、中劑量組大鼠逃避潛伏期則較模型組明顯縮短的趨勢，可能給藥劑量小。

表1 定位航行逃避潛伏期(ˉx±s，n=12)

1.2 空間探索實驗

如表2 所示，葡萄內酯小、中、高劑量組跨越原平臺次數與模型組比較具有顯著性差異(P ＜0.05)。陽性藥對照組和浸膏小、中、高劑量組跨越原平臺次數與模型組比較具有明顯改善。大鼠逃避潛伏期則較模型組有明顯縮短的趨勢。

表2 空間探索結果(ˉx±s，n=12)

3.2 枳殼醇提脂溶性部位與葡萄內酯改善VD 大鼠海馬CA1 區(qū)病理改變

如圖b 所示，HE 染色觀察到模型組大鼠海馬CA1 區(qū)表現出明顯的缺血性病理改變，核固縮和細胞呈無秩序排列。如圖a、c 和d 所示，假手術組、給藥組(浸膏高劑量組和葡萄內酯組)和陽性藥組大鼠海馬CA1 區(qū)組織結構完整，神經元排列整齊、規(guī)則。

圖1 典型海馬錐體細胞照片(HE×400)

3.3 枳殼醇提脂溶性部位與葡萄內酯對VD 大鼠腦組織AchE、SOD 活性和MDA 含量的影響

表3 表明，假手術組、葡萄內酯低、中、高劑量組和枳殼醇提脂溶性部位低、中、高劑量組與模型組相比，大腦組織中AchE 活性明顯高于模型組，有顯著性差異(P ＜0.05)。而假手術組、葡萄內酯低、中、高劑量組和枳殼醇提脂溶性部位低、中劑量組的腦組織中SOD 活性低于模型組，這可能與造模時大鼠處在低溫有關，需進一步驗證。假手術組、葡萄內酯低、中、高劑量組和枳殼醇提脂溶性部位低、中劑量組的腦組織中MDA 含量明顯低于模型組MDA 含量，有顯著性差異(P ＜0.05)。

表3 各組大鼠AchE、SOD 活力和MDA 含量變化(ˉx±s，n=12)

4 討論

采用永久性結扎雙側頸總動脈建立的血管性癡呆模型的模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺的次數明顯減少，表現出一定的癡呆癥狀。與假手術組無論是學習記憶能力(定位航行和空間探索)還是生化指標的檢測(AchE、SOD 活力和MDA含量變化)均存在顯著性差異。

中樞膽堿系統(tǒng)功能下降導致認知能力受損，表現為膽堿能神經功能下降。乙酰膽堿(Ach)降解加快。由于乙酰膽堿性質極不穩(wěn)定，容易出現水解極難準確測定其含量。而乙酰膽堿酯酶(AchE)是Ach 的降解酶，測定腦組織中AchE 的活性可以判斷Ach 含量的變化［12］因而被認為是膽堿能神經元的重要標志酶。葡萄內酯各劑量組及醇提物高劑量組均能降低AchE 的活性，從而促進中樞神經系統(tǒng)中Ach 的遞質水平。這種提高Ach 的方法已經成為治療VD 和AD 等慢性神經組織退化病變最有希望的途徑之一。

SOD 是機體內自由基的清除劑，可以減少自由基對腦組織的損傷作用。本實驗結果顯示，與模型組比較，葡萄內酯低、中、高劑量組和枳殼醇提脂溶性部位低、中劑量組的腦組織中SOD 活性反而降低;與假手術組比較，模型組的SOD 活力升高，其原因可能為造模后大鼠由于缺血缺氧，對急劇增長的活性氧的一種過激反應。

從病理改變來看，枳殼醇提脂溶性部位高劑量組與葡萄內酯各組均能顯著改善，定位航行枳殼醇提脂溶性部位高劑量組與葡萄內酯各組與模型組比較也有顯著差異，而醇提脂溶性部位的中、低劑量只有好轉趨勢卻沒有統(tǒng)計學意義。由此推測葡萄內酯是主要的藥效物質。葡萄內酯分子量小(298.38)、脂溶性強、易透過血腦屏障，通過對AchE 的抑制達到增加Ach 在腦中的含量，從而促進中樞神經系統(tǒng)中Ach 的遞質水平，從而對血管性癡呆起到改善作用。其作用機制還有待進一步研究。

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