張白羽, 李思熳，高振華，申吉泓,*

1. 昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院, 云南 昆明 650000; 2. 昆明醫(yī)科大學, 云南 昆明 650500

導(dǎo)尿管留置是臨床診療中常用的基礎(chǔ)技術(shù), 但導(dǎo)尿術(shù)極易引發(fā)留置導(dǎo)尿管相關(guān)性尿路感染(CAUTI), 90%以上的醫(yī)院獲得性尿路感染與留置導(dǎo)尿管有關(guān)(Burke, 2003)。導(dǎo)尿管留置3 d發(fā)生尿路感染的感染率為31%, ＞5 d為74%, 而長期留置則幾乎為100%(Wagenlehner et al, 2006)。我國醫(yī)院感染中因留置尿管引發(fā)尿路感染的比例為 20.8%～31.7%(Hu, 2005)。此類感染往往是多種微生物混合感染, 可以持續(xù)數(shù)天到數(shù)月, 其中大腸埃希菌(E.coli)是CAUTI病人尿液中最普遍的菌種(Warren et al, 1982)。由于大劑量及廣譜抗生素的濫用, 耐藥細菌的種類增多且耐藥性增強, 諸如“超級細菌”等新型菌種或病毒, 對現(xiàn)有的抗微生物藥物及治療手段提出了巨大的挑戰(zhàn)。

近年來, 抗菌肽以其強大的抗菌及免疫調(diào)節(jié)等作用使得人們對其研究日益深入。具有自主知識產(chǎn)權(quán)的蛇毒Cathelicidin抗菌肽由中國科學院“動物模型與人類疾病機理”重點實驗室“生物毒素與人類疾病”學科組首先發(fā)現(xiàn), 為得到國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項支持的具有極高臨床應(yīng)用前景的抗臨床耐藥病原菌感染候選藥物分子。蛇毒來源的Cathelicidin對許多臨床耐藥微生物顯示了極強的體外抗菌活性, 并具有極低的細胞毒性以及溶血活性(＞400 μg/mL), 同時, 在高鹽度(1% NaCl)及血漿存在下也能保持其抗菌活性, 顯示了較高的臨床應(yīng)用前景(Zhao et al, 2008; Li et al, 2008)。人類泌尿道表達分泌Cathelicidin (hLL-37), 在感染過程中, 上皮細胞迅速增加 Cathelicidin的表達, 通過 hLL-37的直接抗菌作用和其具有的免疫調(diào)節(jié)作用, 與其他分子共同保護泌尿道不受細菌侵入, Cathelicidin家族抗菌肽是泌尿道重要的抗微生物入侵物質(zhì)(Chromek et al, 2006)。

本研究通過使用臨床上泌尿系感染最常見的致病菌—大腸埃希菌建立家兔泌尿系感染模型, 利用蛇毒抗菌肽OH-CATH及目前臨床常用藥物頭孢哌酮舒巴坦進行體內(nèi)實驗, 從而探討新型蛇毒抗菌肽OH-CATH對臨床常見的大腸桿菌引起的泌尿系感染的保護作用, 為蛇毒抗菌肽Cathelicidin將來的臨床應(yīng)用建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細菌制備 用接種環(huán)將普通大腸埃希菌(E.coli ATCC 25922)和耐頭孢菌素大腸埃希菌臨床耐藥株(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科分離并鑒定)分別加入LB 培養(yǎng)液, 37 ℃培養(yǎng)過夜。次日早取20 μL隔夜接種的菌液加入 LB 培養(yǎng)液(2 mL),37 ℃搖床150 r/min繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

1.1.2 蛇毒抗菌肽OH-CATH的制備 成熟蛇毒抗菌肽OH-CATH由30個氨基酸殘基組成, 無二硫鍵,由吉爾生化(上海)有限公司合成, 氨基酸序列為：KFFKKLKNSVKKRAKKFFKKPRVIGVSIPF, 純度＞95%。實驗所用樣品由中國科學院“動物模型與人類疾病機理”重點實驗室“生物毒素與人類疾病”學科組提供。實驗動物使用符合國家動物倫理委員會規(guī)定并遵守國際慣例，昆明醫(yī)學院（實驗動物中心）動物實驗批準號為SCXK（滇）2005-0008。

1.2 實驗方法

1.2.1 雄性家兔泌尿系感染模型的建立 雄性家兔(2.5 kg)購自昆明醫(yī)科大學實驗動物中心。實驗動物消毒后耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉; 仰臥位清洗消毒會陰, 10F雙腔導(dǎo)尿管(Bard公司, Foley雙腔導(dǎo)尿管10F Catheters)前端石蠟油潤滑后行導(dǎo)尿術(shù); 尿液流出后, 球囊內(nèi)注射3 mL生理鹽水固定導(dǎo)尿管; 經(jīng)導(dǎo)尿管注射1 mol/L HCl 5 mL并夾閉尿管5 min后, 注射1 mol/L NaOH 5 mL中和, 隨后生理鹽水沖洗膀胱3次(Asahara et al, 2001);次日, 經(jīng)導(dǎo)尿管注射活化大腸桿菌菌液 1 mL(100 cfu/mL) (Kang et al, 2004; Desnottes et al, 1981;Mever-Siegler et al, 2004), 分別注射兩種菌液得到大腸桿菌標準株及耐頭孢菌素大腸桿菌耐藥株感染的家兔泌尿系感染模型。

1.2.2 實驗分組 本實驗分 5組(A、B、C、D 和E), 每組設(shè)家兔6只。A為大腸桿菌標準株空白對照生理鹽水組、B為大腸桿菌標準株給予蛇毒抗菌肽OH-CATH組、C為大腸桿菌標準株給予頭孢哌酮舒巴坦組、D為耐頭孢菌素大腸桿菌給予蛇毒抗菌肽OH-CATH組以及E為耐頭孢菌素大腸桿菌給予頭孢哌酮舒巴坦組。B、C、D和E組分別取大腸桿菌標準株及耐頭孢菌素大腸桿菌感染的兩種家兔, 夾閉導(dǎo)尿管0.5 h后, 經(jīng)尿管分別注射1 mL抗菌肽(4 mg/mL×200 μL)溶液或頭孢哌酮舒巴坦溶液(30 mg/kg), 夾閉尿管 2.5 h后拔出導(dǎo)尿管回籠飼養(yǎng)。A組的實驗與上述組別相同, 但用生理鹽水替代抗菌肽或抗生素。

1.2.3 數(shù)據(jù)和標本采集 給藥后第 1、5、10、14天, 家兔行導(dǎo)尿術(shù), 取中段尿標本。實驗第14天尿標本采集后處死動物, 每組兩只取膀胱組織, 部分用福爾馬林固定后做H-E染色石蠟切片觀察, 部分用戊二醛固定后做透射電鏡觀察。

1.2.4 中段尿尿培養(yǎng) 為更準確判斷研究動物模型感染水平, 本實驗將中段尿標本用 LB培養(yǎng)液稀釋104及105倍后, 取100 μL行平板細菌培養(yǎng), 37 °C溫箱培養(yǎng)24 h后觀察計數(shù)。培養(yǎng)基配方為： 1%低熔點瓊脂糖(Sigma A6013), 0.3 mg/mL胰蛋白胨(Oxoid產(chǎn)品)溶于10 mmol/L pH 7.4檸檬酸-碳酸氫鹽緩沖液中。滅菌后20 mL培養(yǎng)基搖勻使其在直徑76 mm培養(yǎng)皿中均勻地攤布備用。

2 結(jié) 果

2.1 中段尿培養(yǎng)

正常尿液無菌, 若尿液中菌落數(shù)＞105/mL,即意味泌尿系存在感染(Wu, 2004)。為更準確判斷模型感染水平, 本實驗每只家兔第 1、5、10及 14天尿液樣本用 LB培養(yǎng)液稀釋 104和 105倍后的培養(yǎng)菌落數(shù)以 105cfu/mL為標準, 稀釋后培養(yǎng)結(jié)果菌落數(shù)分別為＞2×107cfu/mL及＞2×108cfu/mL為陽性, 而＜2×107cfu/mL或=0為陰性。據(jù)此標準, 比較各實驗組尿液培養(yǎng)結(jié)果統(tǒng)計陽性率(表 1)。

表1 各實驗組不同時間中段尿培養(yǎng)陽性率(陽性例/總例)比較Table 1 Urine culture positive rate (positive cases / total cases) among experimental groups at different intervals （%）

2.2 膀胱標本

2.2.1 H-E染色石蠟切片 大腸桿菌易引起中性粒細胞大量滲出并伴有不同程度的組織壞死(Wang,2003)。石蠟切片結(jié)果顯示, A組大腸桿菌標準株空白對照生理鹽水組膀胱組織中可見大量壞死組織,炎癥細胞浸潤, 且肌層可見中性粒細胞浸潤; B組大腸桿菌標準株給予蛇毒抗菌肽OH-CATH組膀胱組織未見明顯壞死組織, 可見少量炎癥細胞, 而肌層未見明顯炎癥細胞浸潤; C組大腸桿菌標準株給予頭孢哌酮舒巴坦組未見明顯壞死組織, 可見少量炎癥細胞; D組耐頭孢菌素大腸桿菌給予蛇毒抗菌肽 OH-CATH組膀胱組織未見明顯壞死組織, 可見少量炎癥細胞; E組耐頭孢菌素大腸桿菌給予頭孢哌酮舒巴坦組膀胱組織可見壞死鈣化組織, 炎癥細胞較耐頭孢菌素大腸桿菌給予蛇毒抗菌肽OH-CATH組多(圖1)。

2.2.2 透射電鏡 透射電鏡照片結(jié)果可見A組大腸桿菌標準株生理鹽水對照組膀胱膀胱組織細胞結(jié)構(gòu)紊亂, 可見大量炎性細胞及壞死細胞侵潤, 間質(zhì)水腫, 膠原纖維排列疏松(圖 2A); B組大腸桿菌標準株給予蛇毒抗菌肽OH-CATH組膀胱組織大部分正常細胞排列, 可見少量炎性細胞, 輕微間質(zhì)水腫,大量膠原纖維排列(圖2B); C組大腸桿菌標準株給予頭孢哌酮舒巴坦組膀胱組織大部分正常細胞排列, 可見少量炎性細胞, 輕微間質(zhì)水腫, 大量膠原纖維排列(圖2C); D組耐頭孢菌素大腸桿菌給予蛇毒抗菌肽OH-CATH組膀胱組織正常細胞排列, 未見炎性細胞, 輕微間質(zhì)水腫, 大量膠原纖維排列(圖2D); E組耐頭孢菌素大腸桿菌給予頭孢哌酮舒巴坦組膀胱組織細胞結(jié)構(gòu)紊亂, 可見大量炎性細胞侵潤,間質(zhì)水腫, 膠原纖維排列疏松, 與A組相似(圖2E)。

3 討 論

我們參照國外文獻方法建立了家兔泌尿系感染動物模型(Asahara et al, 2001; Kang et al, 2004;Desnottes et al, 1981; Mever-Siegler et al, 2004), 實驗結(jié)果證明, 該泌尿系感染模型的建立穩(wěn)定可行,且造模的關(guān)鍵在于短時間酸化局部處理對膀胱造成損傷, 有利于細菌感染。

圖1 不同組別膀胱組織H-E染色石蠟切片觀察Figure 1 Investigation of bladder tissues in different experimental groups by H-E stainingA：大腸桿菌標準株生理鹽水對照組; B：大腸桿菌標準株給予蛇毒抗菌肽OH-CATH組。C：大腸桿菌標準株給予頭孢哌酮舒巴坦組; D：耐頭孢菌素大腸桿菌給予蛇毒抗菌肽OH-CATH組; E：耐頭孢菌素大腸桿菌給予頭孢哌酮舒巴坦組。A-1：膀胱組織中可見壞死組織; A-2：膀胱肌層可見中性粒細胞侵潤; A-3膀胱肌層可見中性粒細胞侵潤; B-1：膀胱組織中未見明顯壞死組織; B-2：膀胱組織中未見明顯壞死組織及炎癥細胞; B-3：膀胱組織中未見明顯壞死組織及炎癥細胞; C-1：膀胱組織未見壞死組織; C-2：膀胱組織中未見明顯壞死組織可見少量炎癥細胞; C-3：膀胱組織中未見明顯壞死組織可見少量炎癥細胞; D-1：膀胱組織未見壞死組織; D-2：膀胱組織中可見少量炎癥細胞; D-3：膀胱組織見少量炎癥細胞; E-1：膀胱組織見壞死鈣化組織; E-2：膀胱組織中可見炎癥細胞; E-3：膀胱組織中可見炎癥細胞。A: Saline+OH-CATH group; B: The E. coli ATCC 25922+OH-CATH group; C: The E. coli ATCC 25922+Cefoperazone Shubatan group; D: Drug-resistant E.coli+OH-CATH group; E: Drug-resistant E. coli+Cefoperazone Shubatan group.A-1: The necrotic tissue in the bladder; A-2: Neutrophil invasion in the bladder muscularis; A-3: Neutrophil invasion in the bladder muscularis; B-1: No obvious necrotic tissue in the bladder; B-2: No obvious necrotic tissue and inflammatory cells in the bladder; B-3; No obvious necrotic tissue and inflammatory cells in the bladder; C-1: No obvious necrotic tissue in the bladder; C-2: No obvious necrotic tissue in the bladder but a small amount of inflammatory cells; C-3:No obvious necrotic tissue in the bladder but a small amount of inflammatory cells; D-1: No obvious necrotic tissue in the bladder; D-2: A few inflammatory cells in bladder tissue; D-3: A few inflammatory cells in bladder tissue; E-1: Necrosis calcified tissue in bladder; E-2: Inflammatory cells in the bladder tissue;E-3: Inflammatory cells in bladder tissue.

圖2 不同組別膀胱組織透射電鏡照片F(xiàn)igure 2 TEM images of the bladder tissue in different experimental groupsA：大腸桿菌標準株生理鹽水對照組膀胱組織 (箭頭指示炎性細胞); B：大腸桿菌標準株給予蛇毒抗菌肽OH-CATH組膀胱組織; C：大腸桿菌標準株給予頭孢哌酮舒巴坦組膀胱組織; D：耐頭孢菌素大腸桿菌給予蛇毒抗菌肽OH-CATH組膀胱組織; E：耐頭孢菌素大腸桿菌給予頭孢哌酮舒巴坦組膀胱組織 (箭頭指示炎性細胞)。A: Saline+OH-CATH group (the arrows indicate inflammatory cells); B: E. coli ATCC 25922+OH-CATH group; C: E. coli ATCC 25922+Cefoperazone Shubatan group; D: Drug-resistant E. coli+OH-CATH group; E: Drug-resistant E. coli+Cefoperazone Shubatan group (arrows indicate inflammatory cells).

中段尿培養(yǎng)結(jié)果顯示生理鹽水對照組感染24 h以上尿液培養(yǎng)結(jié)果的陽性率均為 100%。大腸桿菌標準株給予蛇毒抗菌肽OH-CATH組在第14天尿液培養(yǎng)出現(xiàn)陽性, 說明在使用蛇毒抗菌肽 OH-CATH后, 實驗家兔感染率在早期得到了明顯控制, 且作用持續(xù)時間較長, 效果肯定; 頭孢哌酮舒巴坦作為臨床常用的廣譜抗生素, 對大腸桿菌標準株作用明顯, 作用持續(xù)時間長, 第14天尿培養(yǎng)結(jié)果陽性率超過大腸桿菌標準株給予蛇毒抗菌肽 OH-CATH組,提示蛇毒抗菌肽OH-CATH更持久的活性; 對于耐頭孢菌素的大腸桿菌, 蛇毒抗菌肽OH-CATH依然顯示較好的活性, 但作用持續(xù)時間相對大腸桿菌標準株有所減少, 在第 10天即出現(xiàn)了低陽性感染率,而第 14天陽性率則超過半數(shù), 提示蛇毒抗菌肽OH-CATH對耐頭孢菌素大腸桿菌的作用相比對大腸桿菌標準株有所下降; 相對于蛇毒抗菌肽OH-CATH, 頭孢哌酮舒巴坦對耐頭孢菌素的細菌作用明顯降低, 實驗早期即出現(xiàn)感染高陽性率, 且中、后期感染率均為 100%, 幾乎無保護作用(P＜0.05)。

石蠟切片H-E染色和透射電鏡結(jié)果顯示生理鹽水對照組標本膀胱組織感染明顯, 炎癥反應(yīng)嚴重;蛇毒抗菌肽OH-CATH對大腸桿菌標準株及耐頭孢菌素大腸桿菌臨床株引起的感染均有穩(wěn)定活性, 對膀胱組織起到了較好的保護作用; 使用頭孢哌酮舒巴坦的不同組別膀胱標本中, 頭孢哌酮舒巴坦對大腸桿菌標準株ATCC 25922引起的感染有一定保護作用, 組織損傷及炎癥反應(yīng)較輕, 而對于耐頭孢菌素的大腸桿菌臨床株引起的感染無明顯作用。

本研究為臨床泌尿系細菌感染, 特別是耐藥病原菌感染提供了一種潛在的治療手段, 并為臨床尿路感染治療及日益嚴峻的臨床耐藥病原菌的預(yù)防和治療的深入提供了新的思路。