邵 平, 劉 青, 陳純彬, 秦敏樸, 孫培龍

1.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院， 杭州 310014；2.浙江一派食品有限公司， 浙江 金華 321100

靈芝是一類屬于擔(dān)子菌亞門的白腐真菌，在我國作為醫(yī)藥原材料已有上百年歷史，目前已廣泛用于保健品和中草藥的開發(fā)[1,2]。研究表明，靈芝中含有三萜類、多糖甾醇類、氨基酸多肽類、呋喃類衍生物等活性物質(zhì)，對糖尿病、心血管病、腫瘤等疾病的預(yù)防和治療具有一定的功效[3～5]。而多糖作為靈芝中的主要活性成分，傳統(tǒng)提取方法得率較低；若采用酶解法水解多糖，可有效破壞細胞壁，釋放胞內(nèi)多糖，從而增強多糖的提取率[6,7]。

研究表明[8,9]，酶解后的多糖中，仍含有蛋白質(zhì)、果膠等大分子，為了提高多糖純度，需要進一步分離純化。通過超濾，則能對這些雜質(zhì)有效地去除，并能實現(xiàn)不同分子量多糖的分級[10]，便于今后對多糖活性的研究。超濾是一種以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，基于機械篩分原理，以膜兩側(cè)壓差為動力，對雙組分或多組分的液-液混合體系進行分離、分級、提純和富集的溶液分離過程[11]。目前，超濾已用于多糖、中藥、酶制劑等有效成分的提取分離應(yīng)用中[12～14]。Li等[15]用切向流超濾海藻胞外聚合物取得了比較好的效果，并驗證了中試規(guī)?；a(chǎn)的可行性；肖如武等[16]采用超濾對藍蛤蛋白酶解液中不同分子量的呈味肽實現(xiàn)了富集濃縮，其中，小于3 kU肽段的含量由47.26%提高到76.66%；張寧[17]通過截留分子量為50 kDa中空纖維超濾膜濃縮土壤桿菌胞外多糖的發(fā)酵液，去除了發(fā)酵液中的蔗糖、氮源及無機離子，多糖回收率達82.7%。因此，作為分離純化多糖的一種重要手段，超濾越來越受到人們的重視。

本文采用超濾對靈芝多糖酶解液中的蛋白質(zhì)進行脫除，確定了適宜的膜超濾參數(shù)。比較了超濾耦合徑向流色譜法與其他方法脫蛋白的效率，為該法在多糖工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝子實體；苯酚、濃硫酸、氫氧化鈣、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、3,5-二硝基水楊酸、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅，葡萄糖等試劑均為分析純；纖維素酶，8萬U/g，張家港金源生物化工有限公司產(chǎn)品；木瓜蛋白酶，100萬U/g，購自上海藍季科技發(fā)展有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

紫外-可見分光光度計，752型，上海光學(xué)儀器有限公司；低速冷凍離心機，L535R型，長沙湘儀離心機有限公司；恒速攪拌器，S-212型，上海申勝生物技術(shù)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-2型，榮華儀器制造有限公司；電子天平，PL602型，梅特勒-托利多儀器有限公司；pH計，PHSJ-4A型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平，AR1140型，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；超濾系統(tǒng)，Congent M，美國密理博公司；超濾膜為改良聚醚砜復(fù)合膜(PES)，膜面積0.1 m2，膜分子量分別為100 kDa、30 kDa和10 kDa，其中100 kDa膜為tpye C，30 kDa和10 kDa膜為type A。

1.3 實驗方法

1.3.1靈芝多糖的酶解 使用復(fù)合酶(木瓜蛋白酶∶纖維素酶=2∶1)在56℃、pH 7.0條件下水解靈芝子實體多糖，多糖酶解液經(jīng)8 000 r/min離心10 min后，上清液儲存于4℃下備用[18]。

1.3.2超濾膜的選擇 在室溫及壓力小于30 psi條件下，將酶解液依次通過截留分子量為100 kDa、30 kDa和10 kDa的超濾膜，然后測定每段分子量間的多糖含量，分析靈芝多糖的分子量分布。以多糖的截留率、蛋白質(zhì)去除率及膜的性能為指標(biāo)，綜合評價不同孔徑超濾膜的過濾效果。

1.3.3超濾耦合徑向流色譜分離靈芝多糖工藝流程 在不同步驟分別采用徑向流色譜法、軸向色譜法和Sevag法脫除靈芝子實體中的多糖蛋白。

徑向流色譜法：上樣量為100 mL，上樣濃度為10 mL/min，上樣流速為2 mL/min，洗脫流速為50 mL/min；色譜柱參數(shù)：柱體積250 mL，床層高度為3 cm，柱高5 cm。

軸向色譜法：上樣量為100 mL，上樣濃度為10 mL/min，上樣流速為2 mL/min，洗脫流速為50 mL/min；色譜柱參數(shù)為：柱體積250 mL，床層高度為46 cm，柱高50 cm。

Sevag法：取截留液與Sevag試劑(3∶1)混合，分液漏斗中充分振蕩30 min，靜置3 h，取上清液測定蛋白質(zhì)和多糖含量。

1.4 測定和計算方法

總糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[19]。多糖濃度和吸光度的線性回歸方程為：

y=0.007 6x+0.019，R2=0.999 3

其中，y為吸光值，x為葡萄糖含量(μg)。

蛋白質(zhì)含量的測定采用Folin-酚法[20]。牛血清白蛋白濃度與吸光值的線性回歸方程為：

y=0.003 4x+0.095 9，R2=0.998 6

其中，y為吸光值，x為牛血清蛋白含量(μg)。

多糖截留率[21]的計算公式為：

其中，V2，ρ2分別為超濾后浸提液的體積和多糖的質(zhì)量濃度；V1，ρ1分別為超濾前浸提液的體積和多糖的質(zhì)量濃度。

蛋白質(zhì)脫除率的計算公式為：

超濾通量[21～23]用單位時間內(nèi)通過單位面積的透過液量表示：

J=V/tA

其中：J為超濾通量[mL/(cm2·min)]；V為透過液體積(mL)；A為膜的有效面積(m2)；t為超濾時間(min)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖相對分子質(zhì)量分布

將靈芝多糖酶解液依次通過不同孔徑的超濾膜，超濾膜對多糖分子的截流效果見圖1A，其相對分子質(zhì)量分布如圖1B。

圖1 靈芝子實體酶解液中多糖的膜截流率(A)和相對分子質(zhì)量分布(B)Fig.1 Flow rate (A) and relative molecular mass distribution (B) of polysaccharide in hydrolyzate of Ganoderma lucidum fruiting bodies.

由圖1可以看出，酶解液多糖以相對分子質(zhì)量100 kDa以上為主，含量達63.32%；其次為分子量小于10 kDa的多糖，含量為19.96%；相對分子量30～100 kDa及10～30 kDa之間的多糖含量相當(dāng)，分別為8.4%和8.32%。此外，不同分子量的超濾膜對靈芝子實體酶解液多糖的截留率差異顯著，隨著膜孔徑的增大，多糖截留率降低。其中，10 kDa的超濾膜對多糖的截留率約為80.12%，而30 kDa和100 kDa的超濾膜對多糖的截留率分別為71.83%和63.32%。

2.2 不同分子量超濾膜的蛋白去除率

超濾膜在截留多糖的同時，也使得部分大分子蛋白質(zhì)難以脫除。不同分子量的超濾膜對蛋白質(zhì)的脫除效果如圖2所示。

圖2 不同分子量膜對靈芝子實體多糖酶解液的蛋白質(zhì)去除率Fig.2 The protein removal rate of different ultrafiltration membranes from hydrolyzate of Ganoderma lucidum fruiting bodies.

分別對分子量100 kDa、30 kDa、10 kDa超濾膜超濾所得截留液以及濾過液進行蛋白質(zhì)含量測定，結(jié)果顯示，10 kDa和30 kDa超濾膜對蛋白質(zhì)的脫除率分別為70.81%和77.62%，100 kDa超濾膜對蛋白質(zhì)的脫除率最高，達82.21%。隨著超濾膜分子量的增大，蛋白質(zhì)去除率提高。這是由于實驗中用于超濾的靈芝子實體多糖溶液是經(jīng)過纖維素酶和蛋白酶復(fù)合酶解靈芝子實體所得，因此較其他提取方法所得粗多糖溶液，酶解液中含有相對較多的游離小分子蛋白質(zhì)。

2.3 不同分子量超濾膜膜參數(shù)的測定

在料液濃度、超濾時間、料液體積流量等參數(shù)相同的條件下，分別研究純水體積流量對超濾膜通量的影響及酶解液體積流速百分比對超濾系統(tǒng)壓力的影響，結(jié)果如圖3所示。

從圖3A中可以看出，隨著純水體積流速的增加，超濾膜通量均不斷增大，其中尤以100 kDa超濾膜的增速最快。此外，在相同的純水體積流速下，100 kDa超濾膜具有最大的超濾通量。在圖3B中，隨著酶解液體積流速的增加，10 kDa超濾膜的壓力增加最為顯著，30 kDa超濾膜次之，而100 kDa超濾膜最小。30 kDa超濾膜與100 kDa超濾膜在小流速下較為接近，而隨著流速的增加，100 kDa超濾膜的壓力增幅較30 kDa超濾膜小。由于膜材料的不同(10 kDa和30 kDa超濾膜的材料為tpye A，而100 kDa超濾膜的材料為tpye C)，因此三種膜在膜參數(shù)性質(zhì)上并不成比例關(guān)系。

圖3 不同分子量超濾膜的膜參數(shù)Fig.3 Parameters of ultrafiltration by membranes with different cut-off molecular mass.

2.4 料液體積流量對超濾通量及超濾壓力的影響

在料液濃度、超濾時間、濃縮倍數(shù)等相同的條件下，研究了料液體積流量對膜通量及壓力的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液體積流速對超濾性能的影響Fig.4 Effect of flow rate on the ultrafiltration performance.

料液體積流量對超濾通量的影響，主要是由體積流量的增大，料液流動狀態(tài)發(fā)生變化所致。隨著料液體積流量的增加，增大了流體主體湍流程度，減弱了膜面凝膠層和流動邊界層厚度，使?jié)獠顦O化現(xiàn)象減弱，超濾通量增加并趨于穩(wěn)定[21]。料液體積流量對超濾壓力的影響，主要是隨著體積流量的增大，料液即時濃度的增大。當(dāng)單位時間內(nèi)流體中大分子物質(zhì)含量越高，則超濾壓力越大。如圖4所示，當(dāng)體積流量不斷增加，雖然超濾通量不斷增長，但隨之超濾壓力也不斷上升。實驗中，由于超濾膜的壓力承受能力不高于30 psi，因此根據(jù)圖4，選擇20%泵速(500 mL/min)的料液體積流量，即100 mL/min。

2.5 超濾時間對超濾通量及超濾壓力的影響

在料液濃度、料液體積流量、濃縮倍數(shù)等相同的條件下，研究了超濾時間對膜通量及壓力的影響，結(jié)果如圖5所示。

對于高分子溶液，在一定的超濾壓力下，隨著凝膠層厚度的增加，超濾通量會不斷減少。如圖5所示，本實驗的超濾通量-超濾時間的關(guān)系基本符合這一規(guī)律。在超濾運行的初期，因為膜表面無其他物質(zhì)，阻力較小，因此超濾通量維持較穩(wěn)定狀態(tài)；隨著超濾的不斷進行，在膜表面迅速吸附有機膠體等物質(zhì)，超濾通量下降較快[21,22]。綜合考慮超濾通量及壓力，試驗選擇兩條曲線交點的時間，即超濾時間60 min。

圖5 超濾時間對超濾性能的影響Fig.5 Effect of time on ultrafiltration performance.

2.6 濃縮倍數(shù)對超濾分離性能的影響

在料液濃度、料液體積流量、超濾時間等相同的條件下，研究了濃縮倍數(shù)對膜通量及壓力的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 濃縮倍數(shù)對超濾性能的影響Fig.6 Effect of concentration multiple on ultrafiltration performance.

超濾通量曲線顯示，在濃縮倍數(shù)為2～8倍時，通量下降較為顯著，10倍以后逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)。一方面隨著濃縮倍數(shù)的增加，膜表面的凝膠層形成加快及傳質(zhì)層增厚，產(chǎn)生濃差極化現(xiàn)象，使得膜面污染加重[21～23]；此外，料液中溶質(zhì)含量的增加引起滲透壓增加，這兩者均導(dǎo)致超濾通量迅速下降。截留率曲線顯示了濃縮倍數(shù)對其影響，可以看到在濃縮倍數(shù)為2～6倍期間，多糖截留率迅速下降，而當(dāng)濃縮倍數(shù)達到8～10倍后多糖截留率已趨于穩(wěn)定。從生產(chǎn)效率和工藝要求上來考慮，適當(dāng)?shù)臐饪s倍數(shù)，可以減少膜形成不可逆的凝膠層，便于清洗和下一階段的醇沉工藝[21]。因此，綜上所述，濃縮倍數(shù)為15～17倍時較為合適。

考察了三個參數(shù)對超濾通量、超濾壓力及超濾分離性能的影響，得到了100 kDa超濾膜適宜的工藝參數(shù)為：室溫，壓力小于30 psi，料液體積流量100 mL/min，超濾時間60 min，濃縮倍數(shù)為15～17倍，此條件下多糖截留率為63.32%，蛋白質(zhì)去除率為82.21%。

2.7 不同方法脫除靈芝子實體多糖蛋白質(zhì)結(jié)果

實驗研究比較了超濾耦合徑向流色譜法與單一色譜法方法及Sevag法脫除蛋白質(zhì)的效果，分別從蛋白質(zhì)脫除率及多糖回收率兩方面綜合評價，結(jié)果如表1所示。

表1 不同方法脫除靈芝子實體多糖蛋白質(zhì)試驗結(jié)果比較Table 1 Comparison of different protein removal methods.

從表1中可以看出，超濾耦合徑向流色譜脫除靈芝粗多糖中的蛋白質(zhì)有顯著效果，基本實現(xiàn)了完全脫除。單獨使用徑向流色譜脫除酶解液中的蛋白質(zhì)，脫除率僅為80.59%；而同傳統(tǒng)化學(xué)方法相比，蛋白脫除率與多糖回收率分別高出56.84%和30.84%；與軸向色譜比較，蛋白質(zhì)脫除率提高了25%，而多糖回收率基本一致。

3 討論

具有生理活性的多糖分子量一般較高(>10 kDa)[24,25]，靈芝子實體酶解液中分子量10 kDa以下的多糖含量為19.96%，10～100 kDa之間的多糖含量僅有16.72%，酶解液多糖以分子量10010 kDa以上為主。本研究中，100 kDa超濾膜的多糖截留率約為63.32%，蛋白去除率可達82.21%，且在超濾通量及超濾壓力等膜參數(shù)上均優(yōu)于10 kDa和30 kDa超濾膜。因此，在綜合考慮實驗工作效率等的基礎(chǔ)上，選擇100 kDa超濾膜進行研究，而對分子量小于100 kDa的多糖暫不研究。

采用截留分子量為100 kDa的超濾膜對靈芝多糖酶解液中的蛋白質(zhì)進行脫除，合適的工藝條件為:室溫,壓力小于30 psi，料液體積流量100 mL/min，超濾時間60 min，濃縮倍數(shù)為15～17倍，截留液通過超濾和徑向流色譜純化，無需經(jīng)過醇沉工藝，即可達到高蛋白脫除率及多糖截留率。采用該耦合法，蛋白質(zhì)脫除率及多糖截留率分別高達99.24%和89.52%，相比單一色譜法及Sevag法，明顯改善了多糖中的蛋白質(zhì)脫除效果及得率的提高。

參 考 文 獻

[1] Russell R, Paterson M.Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory[J]. Phytochemistry,2006, 67(18):1985-2001.

[2] Chan W K, Cheung C C H, Law H K W,etal..Ganodermalucidumpolysaccharides can induce human monocytic leukemia cells into dendritic cells with immuno-stimulatory function [J].J. Hematol. Oncol., 2008,1:9.

[3] Seto S W, Lam T Y, Tam H L,etal.. Novel hypoglycemic effects ofGanodermalucidumwater-extract in obese/diabetc (db/db) mice[J]. Phytomedicine, 2009, 16: 426-436.

[4] Hsu S C, Ou C C, Chuang T C,etal..Ganodermatsugaeextract inhibits expression of epidermal growth factor receptor and angiogenesis in human epidermoid carcinoma cells:invitroandinvivo[J]. Cancer Lett., 2009, 281(1): 108-116.

[5] Yuen J W, Gohel M D. Anticancer effects ofGanodermalucidum: a review of scientific evidence[J]. Nutr. Cancer, 2005, 53(1): 11-17.

[6] 程俊文,吳學(xué)謙,賀 亮,等.香菇子實體多糖分步酶解法提取研究[J].食用菌學(xué)報,2009, 16(2): 67-71.

[7] 王元鳳,金征宇.酶法提取茶多糖工藝的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,(3): 122-124.

[8] 劉紅梅,李 棟,樊夢丹,等.灰樹花多糖的復(fù)合酶-微波提取、超濾純化及生物學(xué)評價[J].中草藥, 2011,33(4):594-599.

[9] 李 倩,田春芳,劉雯霞,等.超聲波復(fù)合酶法提取軟紫草多糖的工藝優(yōu)化[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2012, 29(6):498-503.

[10] 謝紅旗.周春山.杜邵龍,等.酶法提取、超濾分離香菇多糖新工藝研究[J].食品科學(xué),2007,28(4)：217-219.

[11] 李錦生,傅曉琴,李 冰,等.功能性生物活性物質(zhì)超濾分離純化技術(shù)的研究現(xiàn)狀與進展[J].中國食品學(xué)報, 2010,10(2): 174-179.

[12] Sun H J, Qi D, Xu J Y,etal.. Fractionation of polysaccharides from rapeseed by ultrafiltration: effect of molecular pore size and operation conditions on the membrane performance[J]. Sep. Purifi.Technol.,2011,80: 670-676.

[13] 陳 余. 膜分離技術(shù)在中藥提取分離中的應(yīng)用[J].化學(xué)工程與裝備,2013,(2):126-128.

[14] Toussain G, Ding L H, Jaffrin M Y,etal.. Recover of alpha agarase enzyme from fermentation broths by membrane crossflow filtration [J].Sep. Sci. Technol.,2000,35(5): 795-809.

[15] Li H F, Li Z W, Xiong S Q,etal.. Pilot-scale isolation of bioactive extracellular polymeric substances from cell-freemedia of mass microalgal cultures using tangential-flow ultrafiltration [J]. Process Biochem.,2011,46: 1104-1109.

[16] 肖如武, 趙謀明.藍蛤蛋白酶解液超濾分離特性的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36(5): 23-27.

[17] 張 寧,彭志英.中空纖維超濾膜濃縮胞外多糖PS-9415發(fā)酵液的研究[J].食品工業(yè)與科技,2003,24(2): 24-27.

[18] 林炳誼.徑向流色譜過程動力學(xué)模型的建立及其在靈芝多糖分離純化中的應(yīng)用研究[D].杭州:浙江工業(yè)大學(xué),碩士學(xué)位論文，2011.

[19] Monobe M, Ema K, Kato F,etal.. Immunostimulating activity of a crude polysaccharide derived from green tea (Camelliasinensis) extract[J].Agric. Food Chem.,2008,56(4): 1423-1427.

[20] Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L,etal.. Protein measurement with the Folin-Phenol reagents [J]. J. Biol. Chem.,1951, 193: 265-275.

[21] 楊 寧,趙謀明,崔春等. 仙人掌多糖的超濾膜分離提取及其影響因素[J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2007,35(4): 42-45.

[22] 李 琳,朱 杰,傅曉琴,等.中試超濾系統(tǒng)濃縮分離南瓜多糖[J].食品科學(xué),2009,30(22): 33-36.

[23] 孫 瑜,周永傳,陳德煦.超濾法純化大黃多糖的研究[J].中國中藥雜志,2009,34(2): 165-168.

[24] Suarez E R, Syvitski R, Kralovec J A,etal.. Immunostimulatory polysaccharides fromChlorellapyrenoidosa. A new galactofuranan. measurement of molecular weight and molecular weight dispersion by DOSY NMR[J]. Biomacromolecules, 2006,7(8):2368-2376.

[25] Qiu T, Ma X J, Ye M,etal.. Purification, structure, lipid lowering and liver protecting effects of polysaccharide fromLachnumYM281[J]. Carbohydr. Polym., 2013,98: 922-930.