張紹珊，陳嬌嬌，楊曉萍,*

(1.園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.浙江省松陽縣茶葉市場茶葉檢測中心，浙江 松陽 323400)

植物對機(jī)械損傷或病原菌浸染有著天然防御反應(yīng)，遭受侵害時體內(nèi)通常會發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)來增加自身的抵御能力，其中誘導(dǎo)相關(guān)抗性酶活性發(fā)揮了重要作用[1]。酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物體內(nèi)重要的抗性酶，受傷或感病后植物PPO、POD和PAL等活性增強(qiáng)，與植物抗性的獲得呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性[2-3]。因此，誘導(dǎo)植物PPO、POD和PAL等抗性酶活性被認(rèn)為是發(fā)掘植物內(nèi)在抗性機(jī)制以抵御病原菌浸染、機(jī)械損傷的重要對策。

目前，有關(guān)生防菌[4]、化學(xué)物質(zhì)[5-6]、紫外線[7]等誘導(dǎo)植物感病過程中抗性酶活性增強(qiáng)的研究較多，有關(guān)植物提取物誘導(dǎo)植物感病過程抗性酶活性報道較少，僅Latha等[8]研究報道磨盤草等20種植物提取物通過誘導(dǎo)番茄葉POD、PPO、PAL活性的增強(qiáng)來防御番茄早疫??；Kagale等[9]研究報道夾竹桃等16種植物提取物通過增強(qiáng)小麥葉片POD、PAL活性來防御小麥紋枯病菌的侵染；楊書珍等[10]研究報道蜂膠提取物通過誘導(dǎo)柑橘果皮中PAL、POD、PPO等活性的增強(qiáng)來防御柑橘青霉病等，而有關(guān)植物提取物誘導(dǎo)采后果品機(jī)械損傷或感病過程中抗性酶活性防御病原菌浸染的相關(guān)研究還未見報道。

茶是國際健康飲品，茶葉及其所含功能成分有明顯抑菌能力[11-12]，可用于新鮮果品的防腐保鮮[13]，但其防腐保鮮機(jī)理研究還十分缺乏，更未見茶及其提取物誘導(dǎo)采后果品抗性酶活性的報道。本實驗以曙光油桃為試材，以桃灰霉病菌為供試菌，研究茶提取液對機(jī)械損傷或接種灰霉病菌桃果PPO、POD和PAL活性的誘導(dǎo)，為探明茶提取液防腐保鮮機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

病原菌：實驗所用病菌為灰霉病菌(B o t r y t i s cinerea)，分離于自然發(fā)病的桃果實，經(jīng)分離、純化、形態(tài)分析及顯微觀察證實。將其接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，28℃恒溫培養(yǎng)3d，沿生長均勻、旺盛的菌落邊緣用直徑為5mm的打孔器打取菌餅，按10塊/100mL接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)中，在28℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)4d，用勻漿機(jī)(12000r/min)勻漿30s，制成菌絲懸浮液備用。

果實：供試果實為曙光油桃(Prunus persica var. nectarina)，采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹標(biāo)本園，選擇外觀整齊、成熟度八成熟、無病蟲害和機(jī)械損傷的果實，用2%次氯酸鈉浸泡3min后用自來水沖洗，自然晾干后備用。

茶葉提取物為本實驗室自制。以綠茶為原料，經(jīng)60%乙醇提取、過濾，大孔吸附樹脂吸附、70%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，將濃縮樣品以水稀釋成茶葉提取液(茶多酚含量為1.1%)。

ScTRSum 53型紫外-可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；TDL-5-A型高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 方法

1.2.1 茶葉提取物對采后桃果實酶活性的誘導(dǎo)

用接種針在果實最大直徑處垂直刺4mm(深)×5mm(寬)的傷口，傷口晾干后分別接種無菌蒸餾水和6.0g/L茶葉提取液50μL，1.5h后分別再接種病菌懸浮液25μL。實驗處理如下：P1：果實打孔＋接種處理液；P2：果實打孔＋接種處理液＋接種B. cinerea；CK1：果實不打孔；CK2：果實打孔；CK3：果實打孔＋接種B. cinerea。果實晾干后貯藏于25℃，并保持90%左右的相對濕度。每處理50個果實，各處理重復(fù)3次，分別于0、24、48、72、96h取樣測定酶活性，每次測定的樣品取自10個果實的病健交界處(病斑與完好組織的交接部位)果肉。

1.2.2 PAL酶液制備與活性測定

5g果肉中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入0.1mol/L的硼酸緩沖液20mL(pH8.8，含有10mmol/L巰基乙醇，50mmol/L EDTA-Na2)，冰浴勻漿，12000r/min、4℃離心20min，上清液用于酶活測定。PAL活性測定參照Assis等[14]的方法加以改進(jìn)，在290nm波長處測定吸光度(A290nm)的變化，每小時每克鮮質(zhì)量(FW)的A290nm改變0.01定義為一個酶活力單位U，用U/(g·h)表示。

1.2.3 PPO、POD酶液制備與活性測定

10g果肉中加入0.5g PVP，再加入20mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.4)，冰浴勻漿，12000r/min 4℃離心20min，上清液用于酶活力測定。PPO活性測定參照Tian等[15]方法加以改進(jìn)，在410nm波長處測定OD值的變化；POD活性測定參照田世平等[16]方法加以改進(jìn)，在470nm波長處測定A470nm值的變化。PPO、POD活性均以每分鐘每克鮮質(zhì)量(FW)的A470nm改變0.01定義為一個酶活力單位U，用U/(g·min)表示。

1.2.4 茶葉提取物對采后桃果實灰霉腐病的防止效果

桃果實按照上述方法進(jìn)行處理后貯藏于25℃，分別于24、48、72、96h統(tǒng)計果實發(fā)病率和腐爛程度。每處理20個果實，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結(jié)果采用SPSS軟件中One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析，Duncan氏多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗，結(jié)果以“±s”表示，P＜0.05，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉提取液對采后桃果PAL活性的影響

圖 1 茶葉提取液對打孔桃果PAL活性的影響Fig.1 Effect of tea extract on PAL activity of punched peach fruit

由圖1可知，桃果采后24h PAL活性略有降低，隨后隨放置時間的延長，PAL活性呈緩慢增加趨勢；打孔處理能明顯誘導(dǎo)桃果PAL活性的增強(qiáng)，且隨放置時間的延長，PAL活性呈先升后降趨勢；打孔＋茶葉提取液處理組PAL活性變化趨勢與打孔處理組相似，但與打孔處理組相比PAL活性明顯增強(qiáng)，說明茶葉提取液處理能明顯誘導(dǎo)打孔桃果PAL活性增強(qiáng)。

2.2 茶葉提取液與灰霉病菌聯(lián)合處理對采后桃果PAL活性的影響

由圖2可知，桃果打孔＋接種B. cinerea后PAL活性的變化趨勢與打孔處理相似，均呈先升后降趨勢，但在整個觀察過程中打孔＋接種B. cinerea組桃果PAL活性均高于打孔處理組，打孔＋接種病菌后24h與打孔處理組相比差異達(dá)顯著性水平，且打孔＋接種B. cinerea誘導(dǎo)PAL活性增強(qiáng)速度明顯快于打孔處理，接種后24h PAL活性就達(dá)到峰值，而打孔處理后48h PAL活性才達(dá)到峰值，這些研究結(jié)果表明接種病菌能迅速誘導(dǎo)PAL活性增強(qiáng)。

圖 2 茶葉提取液與灰霉病菌聯(lián)合處理對打孔桃果PAL活性的影響Fig.2 Effect of tea extract and B. cinerea on PAL activity of punched peach fruit

打孔＋接種病菌＋茶葉提取液處理組PAL活性變化趨勢與打孔＋接種病菌處理組一致，但茶葉提取液處理能進(jìn)一步誘導(dǎo)PAL活性的增強(qiáng)，與打孔處理組、打孔＋接種病菌處理組相比差異均達(dá)顯著性水平(除接種后48h外)。

2.3 茶葉提取液對采后桃果PPO活性的影響

圖 3 茶葉提取液對打孔桃果PPO活性的變化Fig.3 Effect of tea extract on PPO activity of punched peach fruit

由圖3可知，桃果采后隨放置時間的延長，不打孔處理組、打孔處理組及打孔＋茶葉提取液處理組PPO活性均呈先升后降的趨勢。打孔處理能明顯誘導(dǎo)PPO活性的增強(qiáng)，打孔后72h內(nèi) PPO活性與不打孔處理組相比差異均達(dá)顯著性水平；茶葉提取液處理能進(jìn)一步誘導(dǎo)打孔桃果PPO活性增強(qiáng)，在整個觀察過程中與打孔處理組相比差異均達(dá)顯著性水平，說明茶葉提取液處理能明顯誘導(dǎo)打孔桃果PPO活性增強(qiáng)。

2.4 茶葉提取液與灰霉病菌聯(lián)合處理對采后桃果PPO活性的影響

由圖4可知，桃果打孔＋接種B. cinerea、打孔＋接種B. cinerea＋茶葉提取液處理后PPO活性變化趨勢與打孔處理一致，均隨處理時間的延長先上升，48h后達(dá)到峰值，隨后又急劇下降。桃果接種病菌后能誘導(dǎo)PPO活性增強(qiáng)，但僅接種24h后與打孔處理組相比差異達(dá)顯著水平；茶葉提取液處理能進(jìn)一步誘導(dǎo)接種病菌組桃果PPO活性增強(qiáng)，與打孔處理相比，接種24、72、96h差異達(dá)顯著水平，與打孔＋接種B. cinerea組相比，接種72、96h差異也達(dá)顯著水平。

圖 4 茶葉提取液與灰霉病菌聯(lián)合處理對打孔桃果PPO活性的變化Fig.4 Effect of tea extract and B. cinerea on PPO activity of punched peach fruit

2.5 茶葉提取液處理對采后桃果POD活性的影響

圖 5 茶葉提取液對打孔桃果POD活性的變化Fig.5 Effect of tea extract on POD activity of punched peach fruit

由圖5可知，桃果采后隨放置時間的延長POD活性呈先升后降的趨勢，48h達(dá)到峰值。打孔處理對桃果POD活性沒有明顯影響，而打孔＋茶葉提取液處理初期能顯著誘導(dǎo)POD活性上升，處理后24h POD活性與不打孔處理組、打孔處理組相比差異達(dá)顯著水平，隨后POD活性下降，與不打孔處理組、打孔處理組相比差異不顯著。

2.6 茶葉提取液與灰霉病菌聯(lián)合處理對采后桃果POD活性的影響

由圖6可知，桃果打孔＋接種B. cinerea及打孔＋接種B. cinerea＋茶葉提取液后POD活性變化趨勢與打孔處理一致，均呈先升后降的趨勢。打孔＋接種B. cinerea處理前期誘導(dǎo)POD活性急劇增強(qiáng)，處理24、48h后POD活性顯著高于打孔處理組，隨后迅速下降，POD活性顯著低于打孔處理組。茶葉提取液處理前期對接種病菌桃果POD活性無明顯影響，在處理后期可一定程度抑制接種病菌桃果POD活性降低，處理72、96h后POD活性顯著高于接種病菌組。

圖 6 茶葉提取液與灰霉病菌聯(lián)合處理對打孔桃果POD活性的變化Fig.6 Effect of tea extract and B. cinerea on POD activity of punched peach fruit

2.7 茶葉提取物對采后桃果灰霉病的防止效果

表 1 茶葉提取物對采后桃果灰霉腐病的防止效果Table 1 Effect of tea extract against Botrytis cinerea of postharvest peach fruit

雖然沒打孔組桃果經(jīng)4d貯藏后均沒有發(fā)病，但打孔組桃果第2天開始感病，且與沒打孔組桃果相比差異達(dá)顯著水平；打孔＋接種病菌組桃果第1天開始感病，且感病率高達(dá)100%，與打孔組桃果相比差異達(dá)極顯著水平，說明該桃果感病性較強(qiáng)。茶葉提取物處理不僅能顯著減少打孔組桃果發(fā)病率與病斑直徑(P＜0.05)，也能顯著減少打孔＋接種病菌組桃果發(fā)病率與病斑直徑(P＜0.05)，表明茶葉提取物能有效提高桃果抗病性，這與茶葉提取物能誘導(dǎo)桃果抗性酶活性一致。

3 討 論

植物誘導(dǎo)抗性是植物受到外界物理、化學(xué)或者生物等因素侵襲時所產(chǎn)生的一種獲得性抗性，使植物獲得抵御病害的能力，從而杜絕或減少化學(xué)藥品的使用。植物抗性的誘導(dǎo)主要表現(xiàn)為木質(zhì)素的產(chǎn)生、植保素的合成與積累、抗性酶活性增強(qiáng)及抗性蛋白的產(chǎn)生，其中植物在抵御機(jī)械損傷或病原微生物侵染過程中，PAL、PPO、POD等抗性酶發(fā)揮了重要作用。PAL是苯丙烷類物質(zhì)代謝途徑的的第一關(guān)鍵酶，與木質(zhì)素、植保素及酚類化合物等抗性物質(zhì)的形成密切相關(guān)[17]。PPO是引起果實褐變的主要因素[18]，但在植物抗病反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用。PPO通過催化木質(zhì)素及酚類氧化產(chǎn)物的形成，構(gòu)成保護(hù)性屏蔽而使細(xì)胞免受病菌的侵害，也可通過醌類化合物的形成直接發(fā)揮抗病作用[19]。POD在植物抵抗病原菌中也發(fā)揮重要作用，主要在木質(zhì)素生物合成的最后一步反應(yīng)過程中催化H2O2分解而發(fā)揮作用[20]。

本實驗結(jié)果表明，桃果機(jī)械損傷后PAL、PPO活性顯著增強(qiáng)，機(jī)械損傷后桃果接種灰霉病菌不僅會進(jìn)一步誘導(dǎo)PAL、PPO活性增強(qiáng)，還能誘導(dǎo)POD活性增強(qiáng)，接種病菌后24h桃果PAL、PPO、POD活性與沒打孔組、打孔組桃果相比差異均達(dá)顯著水平。茶葉提取液處理不僅能誘導(dǎo)機(jī)械損傷組桃果PAL、PPO、POD活性增加，與打孔組相比，處理后24h差異均達(dá)顯著水平，也能誘導(dǎo)接種病原菌組桃果PAL、PPO活性增強(qiáng)。這些研究結(jié)果表明在抵御機(jī)械損傷或接種病原菌引起的桃果感病過程中PAL、PPO、POD發(fā)揮了重要作用。桃果在機(jī)械損傷或接種病原菌后PAL、PPO、POD活性增加過程中，桃果開始感病，但茶葉提取液處理能減緩機(jī)械損傷桃果的發(fā)病率及發(fā)病程度，也能明顯減少病原菌侵染桃果病斑直徑，說明茶葉提取液發(fā)揮防腐保鮮效果是通過誘導(dǎo)桃果PAL、PPO、POD活性增強(qiáng)而實現(xiàn)的。

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