易恒仲, 龍靈芝，周源，曹建國(guó)，張堅(jiān)松

（1. 湖南省胸科醫(yī)院, 湖南 長(zhǎng)沙, 410013， 2. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙, 410013 ）

小細(xì)胞肺癌約為肺癌總數(shù)的20%～25%， 在初次治療中，對(duì)化學(xué)治療及放射治療敏感，但極易復(fù)發(fā)和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，迄今小細(xì)胞肺癌患者的5年生存率僅為7%[1]。目前通過(guò)手術(shù)、化療、放療和綜合治療等手段仍無(wú)法進(jìn)一步降低小細(xì)胞肺癌的死亡率。腫瘤干細(xì)胞( cancerr stem cells，CSCs)的發(fā)現(xiàn)為人們理解腫瘤發(fā)病機(jī)制提供了新視野，亦為肺癌的研究和治療提供新的靶點(diǎn)和方式[2]。 耿沁等[3]從肺癌細(xì)胞系通過(guò)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法得到肺球體細(xì)胞中肺癌干細(xì)胞高度富集并具有致瘤性。Singh 等[2]研究表明Akt 抑制劑LY294002 具有下調(diào)干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2表達(dá)和抑制非小細(xì)胞肺癌側(cè)群細(xì)胞自我更新作用。本文用干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法從人小細(xì)胞肺癌NCI-H446 細(xì)胞系富集和擴(kuò)增肺球體形成細(xì)胞即肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞(lung cancer stem cell like cells, LCSLCs)， 對(duì)比觀察LCSLCs 與NCI-H446 細(xì)胞系細(xì)胞Akt 蛋白磷酸化水平， 同時(shí)考察Akt 特異性抑制劑LY294002 對(duì)LCSLC 自我更新的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

Akt 抑制劑LY294002 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。鼠抗人p-Akt (ser473) 和Akt 單克隆抗體為美國(guó)Cell signalingg 公司產(chǎn)品；鼠抗人β-actin 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司

1.2 細(xì)胞系與成球培養(yǎng)

人小細(xì)胞肺癌NCI-H446 細(xì)胞系購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(中國(guó)上海市)。 細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清100U/mL 青霉素和100U/mL 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 收集細(xì)胞，洗滌除去血清，然后，再用添加100 IU/mL 青霉素G、100 μg/mL 鏈霉素、20 ng/mL 人重組表皮生長(zhǎng)因子、10 ng/mL 人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、2%不含維生素A 的B27 添加物，1% N2添加物(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的DMEM/F12 培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。 在隨后的懸浮培養(yǎng)中，采用超低粘附6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning Inc.,Corning, NY, USA)， 每孔接種細(xì)胞數(shù)不超過(guò)5000個(gè)細(xì)胞。

1.3 肺球體細(xì)胞傳代培養(yǎng)和腫瘤球形成試驗(yàn)

低速溫和離心收集源自NCI-H446 細(xì)胞系肺癌球形成細(xì)胞，然后，用EDTA-胰蛋白酶消化，并用吹打管機(jī)械分散細(xì)胞。 得到的單細(xì)胞懸液，離心除去消化酶，然后，重新懸浮于干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中用于再次成球試驗(yàn)。 在球體達(dá)到50 μm 直徑大小時(shí)傳代(6 天)。 取上述肺球體再次成球細(xì)胞，用干細(xì)胞條件培養(yǎng)基， 以每毫升2000 個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 孔超低粘附培養(yǎng)板。 將不同濃度的LY294002(5.0、10.0、20.0μM)添加到干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)6 天后， 在Nikon Eclipse TE2000-S顯微鏡下計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞球的個(gè)數(shù)。

1.4 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

取SPF 級(jí)突變系雄性Balb/c-nu 小鼠(4 周齡，體重14-18g)12 只，隨機(jī)分為3 組，第1 組，低細(xì)胞數(shù)組(在裸小鼠的右前肢附近的右側(cè)皮下接種人肺癌NCI-H446 細(xì)胞系肺癌球形成細(xì)胞2000 個(gè)/只；在裸小鼠的左前肢附近的左側(cè)皮下接種人肺癌NCI-H446 細(xì)胞系細(xì)胞10000 個(gè)/只)×4 只；第2 組，中細(xì)胞數(shù)組(在裸小鼠的右前肢附近的右側(cè)皮下接種人肺癌NCI-H446 細(xì)胞系肺癌球形成細(xì)胞10000個(gè)/只； 在裸小鼠的左前肢附近的左側(cè)皮下接種人肺癌NCI-H446 細(xì)胞系細(xì)胞100000 個(gè)/只)×4 只；第3 組，高細(xì)胞數(shù)組(在裸小鼠的右前肢附近的右側(cè)皮下接種人肺癌NCI-H446 細(xì)胞系肺癌球形成細(xì)胞100000 個(gè)/只；在裸小鼠的左前肢附近的左側(cè)皮下接種人肺癌NCI-H446 細(xì)胞系肺癌球形成細(xì)胞1000000 個(gè)/只)×4 只。 觀察皮下接種部位的成瘤與否以及成瘤時(shí)間(潛伏期，最長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)為2 個(gè)月)。

1.5 Western Blot

細(xì)胞以PBS 沖洗一遍， 加入1mL 裂解酶緩沖液(50 mM Tris-HCl pH7.4、150 mM NaCl、0.2 mM EDTA、0.2% NP-40、10% 丙三醇、1M β-Me、1 μg/mL 抑肽酶、0.5 μg/mL 抑酶醛肽、0.1 mM Na3VO4、0.5 mM 4NPP、0.5 mM NaF 及蛋白酶抑制劑) 刮取并收集細(xì)胞。 細(xì)胞裂解液經(jīng)13200 × g、 4°C 條件下離心5 min， 制備全細(xì)胞提取物。 Bradford 試驗(yàn)(Bio-Rad Laboratories, Hercule s, CA)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 以10～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離提取的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。 該膜首先在PBST中以脫脂牛奶5%(w/v)進(jìn)行封閉，為了進(jìn)行探針檢測(cè)，隨后以標(biāo)示的一抗孵育，輕微震動(dòng)下，4°C 條件下過(guò)夜。 沖洗膜四次后，以適當(dāng)?shù)倪^(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育上述PVDF 膜1 h。 以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham Biosciences)對(duì)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入SPSS 15.0 for windows evaluation軟件(SPSS Inc,Chicago,IL)，建立數(shù)據(jù)庫(kù)，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示， 用One Way ANOVA 方式行方差分析。 首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，當(dāng)方差齊性時(shí)，各組均數(shù)間的兩兩比較用LSD 法，如果方差不齊， 對(duì)照組均數(shù)與實(shí)驗(yàn)組均數(shù)間的比較用Dunnett 法，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2. 結(jié)果

2.1 人小細(xì)胞肺癌NCI-H446 細(xì)胞系中LCSCs 的富集與擴(kuò)增

如圖1 所示， 體外培養(yǎng)和擴(kuò)增小細(xì)胞肺癌NCI-H446 細(xì)胞系，以干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，在超低粘附6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中懸浮培養(yǎng)6 天，細(xì)胞呈現(xiàn)典型非粘附三維球狀生長(zhǎng)(圖1)。 因此，在本研究中，我們定義干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)得到的肺球體形成細(xì)胞為L(zhǎng)CSLCs，并作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的模型。

圖1 小細(xì)胞肺癌NCI-H446 細(xì)胞系細(xì)胞成球培養(yǎng)

2.2 LCSCs 具有高致瘤特性

為了證明人肺癌NCI-H446 細(xì)胞系肺球體形成細(xì)胞即本文定義的LCSCs 具有更強(qiáng)的體內(nèi)腫瘤形成能力， 我們用不同細(xì)胞數(shù)目的人肺癌NCIH446 細(xì)胞系細(xì)胞和LCSCs 接種Balb/c-nu 免疫缺陷小鼠， 從而得到在體內(nèi)成瘤的最小接種細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明，10000 個(gè)LCSCs 就足夠穩(wěn)定地形成腫瘤，然而，在相應(yīng)的同一模型下至少1000000 個(gè)人肺癌NCI-H446 細(xì)胞系細(xì)胞才能穩(wěn)定導(dǎo)致腫瘤形成，此外，成瘤的時(shí)間長(zhǎng)短亦有很大的差別(肺球體形成細(xì)胞：23 天；NCI-H446 細(xì)胞系細(xì)胞：35 天)。 表明LCSCs 具有高致瘤性(表1)。

表1 人肺癌NCI-H446 細(xì)胞系細(xì)胞和成球細(xì)胞在Balb/cnu 免疫缺陷小鼠的異種移植瘤形成能力比較

2.3 LCSCs 組成性活化Akt

Western blot 分析結(jié)果顯示： 與相應(yīng)非分選細(xì)胞相比，LCSCs 組成性活化Akt，表現(xiàn)為Akt 高磷酸化水平(圖2)。

圖2 LCSCs 與非分選細(xì)胞Akt 磷酸化的比較

用抗p-Akt(ser473)抗體和抗Akt 抗體，進(jìn)行Western blot 分析，β-actin 作為加樣量對(duì)照。UC：非分選細(xì)胞；SFC：肺球體形成細(xì)胞。

2.4 LY294002 降低LCSCs 的Akt 蛋白磷酸化水平

Western blot 分析結(jié)果顯示：Akt 特異性抑制劑LY294002 能有效降低LCSCs 的Akt 蛋白磷酸化水平(圖3)。

圖3 LY294002 對(duì)LCSCs 的Akt 蛋白磷酸化水平的影響

不同濃度LY294002(5.0、10.0、20.0 μM)孵 育人肺癌NCI-NCI-H446 細(xì)胞系肺球體形成細(xì)胞24 h，用抗p-Akt(Ser473)和Akt 抗體進(jìn)行Western blot分析，β-actin 作為加樣量對(duì)照。

2.5 LY294002 抑制LCSCs 自我更新能力

腫瘤球形成試驗(yàn)的結(jié)果表明： 不同濃度LY294002 處理LCSCs 的肺癌球形成數(shù)目顯著降低，成濃度依賴(lài)性(表2)。

表2 LY294002 減少肺癌NCI-NCI-H446 細(xì)胞系肺癌球形成細(xì)胞的肺癌球數(shù)目(Mean±SD, n=3)

3 討論

小細(xì)胞肺癌是一種具有很強(qiáng)侵襲性和高轉(zhuǎn)移性的肺癌，約占肺癌病例總數(shù)的20%～25%[1]。此外，小細(xì)胞肺癌一般是頑固性的， 治療后極易復(fù)發(fā)，這導(dǎo)致其預(yù)后極差[1]。 Eramo 等[4]在2007年首次報(bào)道了肺癌CSCs 屬于CD133+細(xì)胞亞群, 此類(lèi)CSC 具有球體形成能力, 在免疫缺陷小鼠皮下植入1×104個(gè)細(xì)胞即能夠形成腫瘤。然而，一些證據(jù)表明：利用CD133 表達(dá)的能力區(qū)分肺癌干細(xì)胞可能被夸大。例如， 一些CD133 陰性肺癌細(xì)胞也具有自我更新能力[5]。 另一種用于鑒別和分選肺癌干細(xì)胞的方法是基于醛脫氫酶活性。 從NCI-H358 和NCI-H125 肺癌細(xì)胞系分離的ALDH+多數(shù)為高致瘤性的CD133+細(xì)胞。 更為重要的是在有限的研究中ALDH1 蛋白表達(dá)與病人預(yù)后差相關(guān)[6]。 然而，還需要進(jìn)一步的研究確定這些標(biāo)志物作為假定肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物的前景和實(shí)用性。惡性實(shí)體腫瘤組織中的癌細(xì)胞源自上皮細(xì)胞，多數(shù)呈貼壁生長(zhǎng)，阻止貼壁后癌細(xì)胞迅速凋亡，稱(chēng)為失巢凋亡(anoikis)。人們利用CSC 具有anoikis 抗性， 能在無(wú)血清培養(yǎng)條件下， 經(jīng)EGF、FGF 等細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球體的方法分離和富集CSCs, 例如腦瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌和黑素瘤的CSC均具有球體形成能力[7]。耿沁等[3]從人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系通過(guò)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法得到肺球體細(xì)胞中肺癌干細(xì)胞高度富集并具有致瘤性。在本文的研究中，我們以干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，在超低粘附6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中得到的肺球體形成細(xì)胞亦具有自我更新特性和高致瘤性。說(shuō)明源自人小細(xì)胞肺癌NCI-H446 細(xì)胞系肺球體形成細(xì)胞具有LCSCs 特性。

Singh 等利用DNA 染料Hoechst 33342 排除法從非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系分選得到側(cè)群(SP)細(xì)胞具有LCSCs 特性， 同時(shí)發(fā)現(xiàn)SP 細(xì)胞較non-SP 細(xì)胞更高表達(dá)Akt 磷酸化蛋白， 提示：Akt 組成性激活對(duì)于維持LCSCs 特性可能有重要意義[2]。 我們采用Wester blot 分析的結(jié)果也證實(shí)，與親本細(xì)胞系細(xì)胞相比，源自人小細(xì)胞肺癌NCI-H446 細(xì)胞系肺球體形成細(xì)胞高表達(dá)Akt 磷酸化蛋白。說(shuō)明來(lái)自小細(xì)胞肺癌的LCSLCs 具有Akt 組成性活化的信號(hào)途徑特征， 暗示Akt 組成性活化在維持小細(xì)胞肺癌LCSLCs 自我更新中發(fā)揮重要作用。

為了證明Akt 組成性活化在維持小細(xì)胞肺癌LCSLCs 自我更新中發(fā)揮重要作用，我們用不同濃度Akt 活性特異性抑制劑LY294002 處理源自人小細(xì)胞肺癌NCI-H446 細(xì)胞系肺球體形成細(xì)胞觀察Akt蛋白磷酸化水平和自我更新能力的變化。 正如預(yù)期的那樣，研究結(jié)果表明：LY294002 在降低源自人小細(xì)胞肺癌NCI-H446 細(xì)胞系肺球體形成細(xì)胞Akt 蛋白磷酸化水平的同時(shí)， 以劑量依賴(lài)方式抑制肺癌球形成能力。 從而證實(shí)LY294002 具有抑制來(lái)自小細(xì)胞肺癌的LCSLCs 自我更性作用。 因此，突出了靶向抑制小細(xì)胞肺癌LCSCs 中組成性激活A(yù)kt 信號(hào)傳導(dǎo)是一種抑制小細(xì)胞肺癌LCSCs 自我更新功能發(fā)揮治療小細(xì)胞肺癌的新策略的科學(xué)意義。

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