林秀蓮，張新英，葉 煒，3，賴鐘雄

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州350002;2.惠州農(nóng)業(yè)學(xué)校生物工程科，廣東惠州561002;3.三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建三明365509)

龍眼胚性愈傷組織(embryogenic callus，EC)經(jīng)限制生長(zhǎng)保存后能成功地恢復(fù)生長(zhǎng)、進(jìn)行體胚發(fā)生和再生完整植株［1］.然而，組織培養(yǎng)物，尤其是EC，保存的價(jià)值在于能否保持其遺傳穩(wěn)定性，這是衡量限制生長(zhǎng)保存成敗的重要指標(biāo).葉煒［2］研究表明，新誘導(dǎo)的龍眼EC與繼代保存1 a后的EC之間隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNAs，RAPD)譜帶存在一定差異，但在鄰近的繼代周期間的RAPD譜帶類似;郭玉瓊等［3］對(duì)玻璃化超低溫保存的龍眼EC進(jìn)行RAPD遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)的結(jié)果表明，超低溫保存的體細(xì)胞無(wú)性系遺傳穩(wěn)定性基本得到保持，但也發(fā)現(xiàn)存在小量的變異現(xiàn)象，有個(gè)別引物擴(kuò)增的譜帶在超低溫保存前后存在一些差異.RAPD標(biāo)記近年來(lái)在果樹上應(yīng)用較多.迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)RAPD在果樹上的應(yīng)用研究主要集中在品種鑒定、分類研究、系譜分析、遺傳圖譜構(gòu)建、特殊性狀的基因標(biāo)記等方面［4－6］.采用 RAPD 進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)已經(jīng)在桃、小麥［7］、錦橙［8］、荔枝［9］、龍眼［2－3，10］上應(yīng)用.本試驗(yàn)選取不同保存時(shí)間的紅核子龍眼不同發(fā)育階段體胚為材料，利用RAPD技術(shù)分析EC體胚發(fā)生過(guò)程變異的規(guī)律，旨在為龍眼離體種質(zhì)庫(kù)的建立提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料分別為保存5個(gè)月、3 a、13 a的紅核子龍眼胚性培養(yǎng)物，分別取EC、30 d球型胚、30 d早期子葉胚、45 d中期子葉胚、75 d成熟子葉胚和體胚苗［11］，每個(gè)階段各取1個(gè)樣品，重復(fù)3次.

主要儀器設(shè)備有Mastercycler gradier PCR儀(Eppendorf公司)、Avanti 30 Centrifuge Beckman臺(tái)式高速離心機(jī)、AllegraTM21RC Centrifuge Beckman臺(tái)式高速離心機(jī)、TGL-16C普通離心機(jī)、T6 spectrophotometer型分光光度計(jì)、GIS-2008凝膠電泳成像儀、H.H.S WSZ-133-65電熱恒溫水浴鍋、SK-1快速混勻器、DYY-Ⅲ32型電泳槽(18孔)、ZF-90多功能暗箱式紫外透射儀、SERIESZ VX350超低溫冰箱、奧立龍828酸度計(jì)、移液器吸頭(Tips)、50 mL離心管 (Eppendorf管)、PCR薄壁管(200 μL)、Gilson微量移液器、Nichipet FX微量移液器、冷柜、微波爐、BS 110S電子天平、研缽等.

主要試劑:Taq DNA聚合酶、dNTP(dNTP Mix)、Buffer(10×PCR Buffer)、MgCl2、引物、瓊脂糖等購(gòu)自上海Sangon生物工程公司;PVP、Tris-HCl、SDS、EDTA、硼酸、乙醇、異丙醇、溴化乙錠(EB)等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品;液氮購(gòu)自福建省福州第二化工廠.

主要溶液的配制參照郭玉瓊等［3］的方法.

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 基因組DNA的提取參照郭玉瓊等［3］的方法并加以改進(jìn).稱取供試材料1 g，用液氮磨成粉末;將干燥的粉末轉(zhuǎn)入10 mL的離心管中，待液氮揮發(fā)盡，加入3.5 mL DNA Extraction BufferⅠ和0.5 mL 20%SDS，混勻;于65℃水浴箱中溫浴20 min，不時(shí)輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，然后加入1.25 mL KAc(5 mol·L－1)，混勻，于0℃的冰浴中放置20 min;于25000 g、4℃離心20 min，棄沉淀，取上清液移至新離心管中，加入2.5 mL異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，于－20℃的冰柜中放置40 min，沉淀核酸;于20000 g、4℃離心20 min，棄上清液，加入700 μL Extraction BufferⅡ溶解DNA 沉淀;于15000 g、4℃離心15 min，沉淀不溶性雜質(zhì)，棄沉淀，取上清液移至新離心管中，加入等體積的4 mol·L－1LiCl，于5℃的冰箱中放置過(guò)夜沉淀RNA;于15000 g、4℃離心30 min，棄沉淀，取上清液移至新離心管中，加入預(yù)冷的75 μL NaAc(3 mol·L－1)，再加入500 μL預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，于室溫下放置5 min;于15000 g、15℃離心15 min，沉淀DNA，棄上清液，沉淀用500 μL 80%冰乙醇洗脫，晾干后用200 μL TE Buffer溶解，于－20℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 DNA質(zhì)量的檢測(cè) 提取的8 μL基因組DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外透射儀上鑒定DNA質(zhì)量.瓊脂糖凝膠中溴化乙錠的工作濃度為0.5 μg·mL－1，電泳緩沖液為0.5 × TBE.

將提取的DNA樣品，用TE Buffer按一定比例稀釋，并以TE Buffer作空白對(duì)照，裝入比色杯，用T6 spectrophotometer型分光光度計(jì)測(cè)定D260nm和D280nm.D260nm/D280nm可估測(cè)所提取的DNA純度;DNA的濃度=D260nm×50×稀釋倍數(shù).

根據(jù)所測(cè)定的DNA濃度，用TE Buffer將DNA樣品稀釋至50 ng·mL－1，保存于－20℃的冰柜中，用于RAPD-PCR擴(kuò)增的DNA模板.

1.2.3 RAPD 反應(yīng)引物的篩選 引物篩選在葉煒［2］、郭玉瓊［3］、鐘鳳林［10］等方法的基礎(chǔ)上選取上海Sangon生物工程公司生產(chǎn)的34條隨機(jī)引物作為篩選的對(duì)象;以保存13 a的龍眼EC DNA為模板，對(duì)34條隨機(jī)引物進(jìn)行篩選.

1.2.4 RAPD-PCR擴(kuò)增 RAPD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析參照鐘鳳林［10］的方法，采用篩選得到的10條10 bp寡聚核苷酸的隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)在Mastercycler gradient PCR儀上進(jìn)行.反應(yīng)體系25 μL，含 1 μL 50 ng·μL－1DNA 模板、2.5 μL 10 × PCR Buffer、1 μL 10 mmol·L－1dNTPS、0.5 μL 5 U Taq DNA 聚合酶、1 μL 10 mmol·L－1隨機(jī)引物、2.5 μL Mg2+、16.5 μL 無(wú)菌雙蒸水.反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性 10 min;94℃變性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸10 min，45個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存.

1.2.5 變異率的計(jì)算 龍眼EC體胚發(fā)生過(guò)程的遺傳距離按如下公式計(jì)算:R=1－2Nxy/(Nx+Ny).式中，R表示種質(zhì)X和種質(zhì)Y的遺傳距離;Nxy表示種質(zhì)X和Y經(jīng)RAPD反應(yīng)后共有的擴(kuò)增譜帶數(shù);Nx、Ny分別表示X和Y種質(zhì)具有的總擴(kuò)增譜帶數(shù).

龍眼EC體胚發(fā)生過(guò)程的變異率用遺傳距離的百分?jǐn)?shù)表示:變異率/%=R×100.

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼EC不同發(fā)育階段體胚DNA RAPD擴(kuò)增引物的篩選

對(duì)龍眼EC體胚發(fā)生過(guò)程中的基因組DNA的純度和濃度進(jìn)行分析，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所選取的樣本適合進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行引物篩選.

以保存13 a的EC(LC2胚性細(xì)胞系)的DNA為模板，對(duì)36條10 bp的隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，共篩選出10 條多態(tài)性好、譜帶清晰的引物 S11、S12、S47、S76、S85、S92、S114、S125、S130、S181 作為 RAPD-PCR 擴(kuò)增的引物.

2.2 龍眼EC不同發(fā)育階段體胚RAPD的擴(kuò)增結(jié)果

采用已篩選的10條隨機(jī)引物對(duì)保存5個(gè)月、3a、13a的龍眼EC體胚發(fā)生過(guò)程中的基因組進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1、表1.

對(duì)保存5個(gè)月的EC不同發(fā)育階段體胚的基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增.結(jié)果(表1)表明，保存5個(gè)月的EC不同發(fā)育階段體胚共擴(kuò)增出220條譜帶.EC、球形胚、早期子葉胚、中期子葉胚、成熟子葉胚、體胚苗等 6 個(gè)階段的相對(duì)變異率分別為 0.91% 、0.45% 、2.27% 、2.73% 、3.18% 、2.27% .

對(duì)保存3 a的EC不同發(fā)育階段體胚的基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增.結(jié)果(表1)表明，保存3 a的EC不同發(fā)育階段體胚共擴(kuò)增出196條譜帶.EC、球形胚、早期子葉胚、中期子葉胚、成熟子葉胚、體胚苗等6個(gè)階段的相對(duì)變異率分別為 5.10% 、2.55% 、5.10% 、1.53% 、1.02% 、1.02% .

圖1 10條隨機(jī)引物對(duì)不同保存時(shí)間的龍眼EC不同發(fā)育階段體胚RAPD擴(kuò)增的圖譜Fig.1 RAPD pattern amplified by 10 selected primers in longan embryogenic cultures at different developmental stages during somatic embryogenesis under different time of minimal growth conservation

表1 10條隨機(jī)引物對(duì)不同保存時(shí)間的龍眼EC不同發(fā)育階段體胚RAPD的變異情況Table 1 DNA amplification results of longan embryogenic cultures at different developmental stages during somatic embryogenesis cultured for different conservation time by different primers

對(duì)保存13 a的EC不同發(fā)育階段體胚的基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增.結(jié)果(表1)表明:保存13 a的EC不同發(fā)育階段體胚共擴(kuò)增出212條譜帶.EC、球形胚、早期子葉胚、中期子葉胚、成熟子葉胚、體胚苗等6 個(gè)階段的相對(duì)變異率分別為 0%、1.89%、1.42%、1.89% 、3.77%、3.30%.

3 討論

3.1 龍眼EC不同發(fā)育階段體胚的遺傳穩(wěn)定性

在離體培養(yǎng)的過(guò)程中，體細(xì)胞無(wú)性系變異應(yīng)該是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，盡管在繼代過(guò)程中不斷產(chǎn)生變異細(xì)胞，但諸如程序性死亡程序可能不斷地淘汰變異細(xì)胞，最終使變異保持在一定的水平上［12－13］，培養(yǎng)基的選擇作用可能最終導(dǎo)致一種主要的核型成為優(yōu)勢(shì)核型［14］.本試驗(yàn)對(duì)保存5個(gè)月、3 a、13 a的紅核子龍眼胚性培養(yǎng)物進(jìn)行體胚發(fā)生，分化率均可以達(dá)到100%，且都能完成正常分化，再生完整植株.利用RAPDPCR檢測(cè)3個(gè)保存時(shí)間的龍眼EC體胚發(fā)生再生植株基因組DNA差異的結(jié)果表明，同一基因型的龍眼EC在分化體胚的過(guò)程中確實(shí)存在一定的遺傳變異，但不同保存時(shí)間的EC在體胚發(fā)生過(guò)程中的相對(duì)變異率都保持在比較小的變異范圍內(nèi)(小于5.1%).因此，龍眼EC作為離體保存材料，在實(shí)際應(yīng)用上是可行的，可以用于龍眼離體種質(zhì)庫(kù)的建立.植物愈傷組織存在變異是一種普遍的現(xiàn)象，在榨菜［15］、甜菜［16］、大蒜［17］等作物的愈傷組織及其再生植株也存在RAPD多態(tài)性現(xiàn)象，是否能在實(shí)際中用于離體種質(zhì)的保存，關(guān)鍵在于其變異率是否在允許范圍之內(nèi).

3.2 龍眼EC不同發(fā)育階段體胚DNA的變異機(jī)理

林秀蓮等［18］對(duì)3個(gè)保存時(shí)間龍眼EC體胚發(fā)生過(guò)程中的染色體數(shù)目進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)它們之間的染色體數(shù)目存在差異.本試驗(yàn)結(jié)果表明:3個(gè)保存時(shí)間龍眼EC體胚在發(fā)生再生植株的過(guò)程中，DNA遺傳物質(zhì)發(fā)生了變化.這種變異可能與染色體畸變、DNA的甲基化、轉(zhuǎn)座子活化等有關(guān).本試驗(yàn)結(jié)果有助于進(jìn)一步探索龍眼離體培養(yǎng)和體胚分化的分子機(jī)理.

早期研究認(rèn)為，無(wú)性系變異可能是供體植物細(xì)胞中預(yù)先存在的變異或嵌合細(xì)胞所造成的.但隨著植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，大量試驗(yàn)證明變異主要發(fā)生在組織培養(yǎng)中，即細(xì)胞脫分化和再分化過(guò)程中.多數(shù)試驗(yàn)證明變異主要發(fā)生在外植體脫分化形成愈傷組織和愈傷組織繼代的過(guò)程中，對(duì)變異機(jī)理和影響因素的探討，目前也主要集中在此階段的研究上.薛啟漢等［19］在對(duì)甘薯EC以及相應(yīng)的體細(xì)胞胚胎DNA指紋多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)，EC僅在2個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)變異，體細(xì)胞胚胎無(wú)性系中有14個(gè)位點(diǎn)發(fā)生不同位點(diǎn)的變異，從而說(shuō)明甘薯在細(xì)胞脫分化階段DNA已開(kāi)始發(fā)生變異，但體細(xì)胞無(wú)性系變異大量發(fā)生階段仍然是體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)階段.荔枝白色胚與玻璃化胚之間存在DNA差異，表明玻璃化胚與白色胚已存在一定的遺傳差異［9］.曾黎輝等［20］用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)研究了龍眼變異單株的多樣性及其來(lái)源，為龍眼種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與利用提供了一定的參考價(jià)值.而在本試驗(yàn)中，由于愈傷組織及其體胚發(fā)生再生植株過(guò)程的遺傳變異機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，需要多種途徑加以分析驗(yàn)證，因此對(duì)本試驗(yàn)所獲得的變異體還需進(jìn)一步進(jìn)行遺傳分析.

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