丁文姣，李曉蓉，董 俊

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070）

土著菌種發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)利用周圍自然環(huán)境的生物資源，即采集本地土壤中的多種有益微生物，通過(guò)對(duì)這些微生物進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)繁，形成有相當(dāng)活力的微生物母種，再合成菌劑用于發(fā)酵床養(yǎng)豬，菌劑的安全及可靠是其進(jìn)行推廣的基礎(chǔ)與前提。為此，我們對(duì)前期分離篩選的土著菌種進(jìn)行了安全性檢驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌種為2010年7月至2011年4月從蘭州、武威、臨洮3地采集不同種類樣品的分離所得（見表1）和活力99生酵劑（市售）。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA），肉汁胨瓊脂（BPA），肉汁胨培養(yǎng)液。供試小白鼠為昆明系小白鼠，標(biāo)準(zhǔn)體重20 g左右，共100只，雌雄各半，購(gòu)于蘭州大學(xué)。

表1 供試標(biāo)樣來(lái)源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種分離及純化 在超凈工作臺(tái)用滅菌器械挑取標(biāo)樣1 g左右于滅菌錐形瓶?jī)?nèi)，用無(wú)菌水定容到100 mL，震蕩20 min后靜置5 min，然后將其稀釋到質(zhì)量濃度為10-8g/mL，分別在10-4、10-6、10-8g/mL濃度下各取0.5 mL懸液平鋪于PSA平板上；再將10-2、10-4、10-6g/mL 3個(gè)濃度懸液80℃恒溫水浴處理30 min后各取0.5 mL平鋪于BPA平板上，每處理5個(gè)平板，37℃黑暗條件下培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)好的平板，統(tǒng)計(jì)每個(gè)標(biāo)樣所分離出菌種的類型計(jì)數(shù)，并挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌種劃線接入BPA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，在PSA平板上培養(yǎng)聞味初篩，挑取氣味不刺鼻的單菌落作為備選菌種保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種安全性毒力試驗(yàn) 將備選菌種活化至PSA，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將活化好的菌種接種至肉汁胨培養(yǎng)液，37℃恒溫條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)好的菌液于血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算1 mL菌液的活菌數(shù)。試驗(yàn)設(shè)菌種接種為主處理（A），共9個(gè)，處理A1為用菌種JZ1接種2次，處理A2為用菌種JZ2接種2次，處理A3為用菌種JZ3接種2次，處理A4為用菌種JZ4接種2次，處理A5為用菌種JZ5接種2次，處理A6為用菌種JZ6接種2次，處理A7為用菌種JZ7接種2次，處理A8為用菌種JZ8接種2次（活力99生酵劑，菌種對(duì)照），處理⑨為不接種，空白對(duì)照。設(shè)接種處理方式和接種菌液量為副處理（B），共3個(gè)，處理B1為灌胃0.25 mL/只，處理B2為灌胃0.50 mL/只，處理B3為腹腔注射0.50 mL/只。每處理取6只小鼠（雌雄各3只），先用菌液濃度為5×108個(gè)/mL的菌種接種1次，飼養(yǎng)觀察14 d后再用菌液濃度為50×108個(gè)/mL的菌種接種1次，飼養(yǎng)觀察14 d。試驗(yàn)前1 d給小鼠斷食斷水，接種處理好的小鼠1 h后正常喂食飲水，在20℃恒溫條件下飼養(yǎng)觀察。

表2 代表性菌種及來(lái)源

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離純化結(jié)果

通過(guò)對(duì)采集自蘭州、武威、臨洮3地不同樣源類型的19個(gè)樣品標(biāo)本經(jīng)分離、純化，共獲得純化菌種167株。

2.2 菌種安全性評(píng)價(jià)

根據(jù)對(duì)功能菌的樣源地、樣品類型、產(chǎn)酶特點(diǎn)、生長(zhǎng)狀況的綜合分析，選取前期試驗(yàn)中獲得的具有代表性的土著功能菌種7株和商品菌種作為菌種對(duì)照布置毒力試驗(yàn)，代表性菌種及來(lái)源見表2。

試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，從菌種接種方面可以看出，第1次接種后飼養(yǎng)觀察14 d，各處理對(duì)小鼠采食狀況、飲水、行為能力以及體貌特征如毛況等均無(wú)影響，小白鼠均未出現(xiàn)死亡。第2次接種后飼養(yǎng)觀察14 d，各處理的小白鼠也均未出現(xiàn)死亡，采食和精神狀態(tài)良好。接種2次后各處理小白鼠的生長(zhǎng)情況同接種前。試驗(yàn)結(jié)束后剖解觀察小白鼠各臟器（如心臟、肺臟、肝臟、腎臟、胃、腸、氣管、生殖器官等部位）均無(wú)病變且無(wú)出血點(diǎn)，表明所選7個(gè)土著菌種安全無(wú)毒。進(jìn)一步將這些菌種對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小白鼠經(jīng)口灌胃法、腹腔注射法進(jìn)行毒力試驗(yàn)的結(jié)果表明，不同菌液用量灌胃處理和腹腔注射處理的小白鼠均未出現(xiàn)死亡，且采食狀況、行為能力以及精神狀態(tài)均無(wú)異常。綜合以上結(jié)果，試驗(yàn)評(píng)價(jià)的7株土著功能菌種均安全可靠，可以用于豬發(fā)酵床制作接種并作為合成菌劑的備選菌種。

表3 選取菌種安全性試驗(yàn)

3 小結(jié)與討論

1）試驗(yàn)篩選出的7個(gè)土著菌種菌株均為甘肅地區(qū)土著功能菌種。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同菌液用量灌胃處理和腹腔注射處理的小白鼠均未出現(xiàn)死亡，且小白鼠采食狀況、行為能力以及精神狀態(tài)均無(wú)異常，即7株土著功能菌種均安全可靠，可以用于豬發(fā)酵床制作接種并作為合成菌劑的備選菌種，但今后尚需進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，繼續(xù)進(jìn)行長(zhǎng)期的安全性評(píng)價(jià)。

2）發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)自近年傳入我國(guó)后，目前不分南北都有采用，商業(yè)公司宣傳為“生物環(huán)保養(yǎng)豬法”。但實(shí)際生產(chǎn)中存在許多客觀問(wèn)題，因此，對(duì)合成菌劑的菌種在菌劑合成之前進(jìn)行安全性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，建立適合我國(guó)國(guó)情的菌種安全性評(píng)價(jià)體系，對(duì)保證發(fā)酵床養(yǎng)殖的安全性有重要的意義。