李慧敏，林雋峰，張 帆，顧玉微，顧 萍，傅啟華，王 靜

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，上海200127)

ABO血型系統(tǒng)中，除正常ABO血型外，還存在一些抗原性較弱的亞型。B(A)血型是一種比較罕見的亞型，據(jù)報(bào)道B(A)血型在歐洲高加索人種中發(fā)生頻率非常低，約為1/(17～18)萬[1]，也有文獻(xiàn)粗略計(jì)算過，B(A)血型在我國北方獻(xiàn)血員中的發(fā)生頻率可能為1/(5～10)萬，遠(yuǎn)高于歐洲人種[2]。而其實(shí)際發(fā)生頻率尚待調(diào)查。其血清學(xué)表現(xiàn)為紅細(xì)胞表面攜帶正常的B抗原和少量的A抗原，以及和O型紅細(xì)胞相等量的H抗原，血清中可檢測到抗A抗體。我們?cè)谌粘Ｑ丸b定中，發(fā)現(xiàn)1例血清學(xué)鑒定困難者，經(jīng)基因鑒定為B(A)04/O06血型。

材料和方法

一、研究對(duì)象

患兒，女，8個(gè)月齡，擬手術(shù)入上海兒童醫(yī)學(xué)中心兒外科，術(shù)前血型血清學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)ABO血型正反定型不符?；純貉囵B(yǎng)呈陰性，輸血相關(guān)傳染病指標(biāo)檢查均呈陰性。采集患兒靜脈血標(biāo)本，以0.109 mol/L檸檬酸鈉1∶9抗凝，用于抽提DNA，－80℃凍存。

二、儀器與試劑

WADiana/8XT全自動(dòng)血型儀、DG Gel Confirm卡、DG Gel Neutral卡及DG Gel Coombs卡由西班牙Diagnostic Grifols，S.A公司生產(chǎn)?？骨虻鞍自噭慰寺】笰抗體、單克隆抗B抗體、ABO細(xì)胞、抗體篩查細(xì)胞由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)。TIANamp Blood DNA Kit、Universal DNA Purification Kit及TIANprep Mini Plasmid Kit試劑盒由北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)。pGEM-T Easy Vector SystemⅠ試劑盒由Promega公司生產(chǎn)。引物設(shè)計(jì)參照NCBI GenBank中ABO基因序列(序列號(hào)FR828573.1)，由華大基因生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增試劑由C-TaKaRa公司(大連寶生物)生產(chǎn)。

三、血型血清學(xué)試驗(yàn)

1.微柱凝集法 用微柱凝集法進(jìn)行血型鑒定、直接和間接抗球蛋白試驗(yàn)、抗體篩查，試驗(yàn)方法按照公司提供的操作手冊(cè)進(jìn)行。

2.試管法 用試管法進(jìn)行血型鑒定、經(jīng)典抗球蛋白試驗(yàn)、抗體篩查。試驗(yàn)方法按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)[3]進(jìn)行。

四、基因鑒定

1.PCR擴(kuò)增與測序 提取患者外周血基因組DNA，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)總體積25μL，包括 Taq DNA 聚合酶(10 mmol/L)0.2μL，10×緩沖液2.5μL，10 mmol/L dNTP 2μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 1μL，DNA 模板 1μL、H2O 17.3μL。擴(kuò)增條件:95℃ 5 min，然后95℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后直接測序，所用儀器為ABI 3730 DNA測序儀。

表1 ABO血型基因鑒定Exon6和Exon7引物序列

2.PCR產(chǎn)物的克隆與測序 (1)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增與純化。合成克隆引物，見表1，PCR反應(yīng)總體積50μL，包括Taq DNA聚合酶(10 mmol/L)0.5μL，10×緩沖液5μL，10 mmol/L dNTP 4μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 2μL，DNA 模板2μL、H2O 34.5μL。擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min，然后95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠純化回收;(2)PCR產(chǎn)物的克隆。進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系如下:2×緩沖液 5μL，pGEM-T Easy載體1μL，T4 DNA 連接酶 1μL，PCR 產(chǎn)物 1μL。連接條件為25℃連接4 h。取10μL連接產(chǎn)物按常規(guī)步驟轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌，鋪于含氨芐西林、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷和 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的LB瓊脂糖平板上，37℃過夜，次日隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)白色單一菌落分別在LB培養(yǎng)液中振蕩過夜，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，送測序。

結(jié) 果

一、血型血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

試管法中，患兒紅細(xì)胞與單克隆及人源抗A抗體反應(yīng)均呈陽性(++)，與單克隆及人源抗B抗體反應(yīng)均呈強(qiáng)陽性(++++)，與單克隆抗H抗體反應(yīng)呈強(qiáng)陽性(++++)，見表2。同時(shí)將O細(xì)胞、B細(xì)胞與抗H抗體反應(yīng)作為對(duì)照，分別呈強(qiáng)陽性(++++)和陽性(+)。

表2 患兒的血型血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

二、基因鑒定結(jié)果

對(duì)患兒DNA的第6、7外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行基因測序，并進(jìn)行PCR產(chǎn)物的克隆與測序，其結(jié)果與Blood Group Antigen Gene Mutation Database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.cgi cmd=bgmut/systems_info＆system=abo)進(jìn)行比較。以A101為標(biāo)準(zhǔn)序列，發(fā)現(xiàn)存在堿基位點(diǎn)的變異，見表3。由于6號(hào)外顯子存在移碼突變，故同時(shí)將其進(jìn)行反向測序。通過ABO基因第6、7外顯子序列分析最終確定其基因型為B(A)04/O06。并通過PCR產(chǎn)物的克隆測序發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn) 261del、c.646T＞A、c.681G ＞A、c.771C ＞ T、c.829G ＞ A 位于同一等位基因，多態(tài)性位點(diǎn) c.297A ＞G、c.526C ＞G、c.657C ＞ T、c.703G ＞ A、c.796C ＞ T、c.803G ＞ C、c.930G＞A及突變位點(diǎn)c.640A＞G位于另一等位基因。見圖1。

表3 E6和E7中的變異位點(diǎn)

圖1 患者ABO基因第6和第7外顯子測序結(jié)果

討 論

ABO血型存在3個(gè)等位基因，分別是A、B和O，定位于染色體區(qū)域9q34.2，其中A等位基因(α-1，3N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶基因)和B等位基因(α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因)編碼354個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性，能將相應(yīng)的糖基連接到前體物質(zhì)H抗原上，形成A和B抗原。而ABO亞型的出現(xiàn)主要是由于糖基轉(zhuǎn)移酶基因第6和第7外顯子基因位點(diǎn)發(fā)生了突變，減低或改變了酶的活性，導(dǎo)致紅細(xì)胞上表達(dá)的A或B抗原的種類或數(shù)量發(fā)生改變，血型血清學(xué)正反定型不符。最新文獻(xiàn)報(bào)道，ABO基因上游啟動(dòng)子的一段堿基缺失(-35_-18del)與ABO亞型有關(guān)，該文獻(xiàn)作者認(rèn)為可能是由于啟動(dòng)子的堿基缺失影響到轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，使啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性降低，進(jìn)而影響到糖基轉(zhuǎn)移酶的活性[4]。

B(A)血型是一種罕見的ABO亞型，人群中發(fā)生頻率非常低，最早發(fā)現(xiàn)于1985年[5]，國內(nèi)首先采用分子診斷技術(shù)所做的類似研究最早見于2004年[6]。而本研究所報(bào)道的由nt640A＞G所引起的B(A)04型等位基因則在2005年第1次報(bào)道[7]。B(A)血型紅細(xì)胞上含有少量A抗原活性和接近正常的B抗原特異性，H抗原含量接近O型細(xì)胞但明顯高于正常B型細(xì)胞，B(A)血清中含有的抗A，可以凝集A1細(xì)胞和部分A2細(xì)胞，因此血清學(xué)表現(xiàn)為血清中含抗A且紅細(xì)胞抗原呈AB型(A弱B強(qiáng))[8]。目前認(rèn)為，B(A)亞型的產(chǎn)生可能是正常B等位基因發(fā)生的單堿基突變，導(dǎo)致變異的B基因具有編碼雙功能活性酶的能力[2]，因此，血清學(xué)表型除了表現(xiàn)幾乎正常的 B抗原特異性外，還表現(xiàn)少量A抗原特異性，且其紅細(xì)胞上H抗原含量接近O型紅細(xì)胞，強(qiáng)于正常B型細(xì)胞，具有較強(qiáng)的H抗原[7]，此點(diǎn)在我們所做對(duì)照實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)。

目前報(bào)道的B(A)亞型共6種，為B(A)01～06，國內(nèi)報(bào)道的B(A)亞型多為B(A)02(c.700C＞G)、B(A)04(c.640A ＞ G)以及 B(A)05(c.641T ＞C)。其中 B(A)04(c.640A ＞ G)和 B(A)05(c.641T＞C)均導(dǎo)致第214位氨基酸的改變，前者由甲硫氨酸(Met)變?yōu)槔i氨酸(Val)，后者則變?yōu)樘K氨酸(Thr)。此外，B型的另一亞型即Bel01亞型也涉及到214位氨基酸的改變，與前兩者不同的是Bel01亞型是在nt641位發(fā)生了T＞G的改變，相應(yīng)地導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶第214位氨基酸由Met改變?yōu)锳rg，上述3種亞型均由同一位置的氨基酸改變所引起，但是Bel01亞型卻有著和B(A)亞型不一樣的血型特點(diǎn)，表現(xiàn)為紅細(xì)胞表面含有少量B抗原活性，H抗原含量接近O型紅細(xì)胞，但明顯高于正常B型細(xì)胞。有趣的是，214位氨基酸若為Met，則表現(xiàn)為B101血型特點(diǎn);若為Val，則表現(xiàn)為 B(A)04特點(diǎn);若為 Thr，則表現(xiàn)為B(A)05的特點(diǎn);若為Arg，則表現(xiàn)為Bel01的特點(diǎn)。且除了Arg為堿性氨基酸外，其它均為中性氨基酸，由此推斷糖基轉(zhuǎn)移酶的214位氨基酸是非常關(guān)鍵的位點(diǎn)，可能處于糖基轉(zhuǎn)移酶的活性結(jié)構(gòu)域，決定糖基轉(zhuǎn)移酶的種類和活性，以至于同一位置不同種類和不同性質(zhì)的氨基酸置換導(dǎo)致血清學(xué)表型出現(xiàn)巨大差異。關(guān)鍵核苷酸位置上的突變及其引起的單個(gè)氨基酸位置上的變化，完全有可能改變糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)特點(diǎn)和催化活性，使同一底物催化形成不同的產(chǎn)物[9]。

本例報(bào)道的為B(A)04/O06亞型，理論上B(A)血型個(gè)體絕大多數(shù)基因型應(yīng)該是B(A)/O的雜合型，但亦出現(xiàn)過B(A)/A1型的報(bào)道[9]。而B/B純合型也有過報(bào)道[2]，為同時(shí)具有B(A)02型等位基因和B101型等位基因，可能表達(dá)部分正常的 B型抗原并同時(shí)具有一些B(A)血型特征。

血型基因分型技術(shù)作為一種分子診斷技術(shù)，是在分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展中建立起來的，與血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)相比，它具有很多的優(yōu)點(diǎn)和長處，其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在不受血清中自身抗體、不規(guī)則抗體的影響;其次，不受受檢者自身所患疾病的影響。當(dāng)遇到臨床血清學(xué)血型鑒定困難時(shí)，血型基因分型的快速性和準(zhǔn)確性更使其可以作為解決這類問題的首選方法。因此，基因分型法具有血清學(xué)無法比擬和不可替代的優(yōu)勢。

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