仉 英，田月如，艾芙琪，劉 紅，馬逸珉，王 蓓，蔣曉飛

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200040)

由于抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致臨床菌株的耐藥性不斷增強(qiáng)。最主要的耐藥機(jī)制是通過(guò)質(zhì)?；蚱渌梢苿?dòng)原件獲取并不斷積累各種耐藥基因，導(dǎo)致同一菌株攜帶多種耐藥基因而產(chǎn)生多重耐藥、泛耐藥。我們研究小組通過(guò)研究2006年8月至2009年12月共57株泛耐藥臨床肺炎克雷伯菌株，發(fā)現(xiàn)其主要為2種多位點(diǎn)序列分析(multilocus sequence typing，MLST)型別:ST423型(HS062105)和ST11型(HS082416)，所有菌株都攜帶 KPC-2、CTXM-14和 SHV-12型 β-內(nèi)酰胺酶基因。為研究泛耐藥臨床肺炎克雷伯菌積累多種β-內(nèi)酰胺酶基因的原因，以及每種耐藥酶在耐藥機(jī)制中所起的作用和其相互之間的作用，將這些基因從臨床菌株中逐一敲出，并逐一回補(bǔ)到肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中，這種快速、高效的研究方法目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究小組成功地運(yùn)用λ red同源重組法敲除了一株ST423型(HS062105)和一株ST11型(HS082416)肺炎克雷伯菌臨床菌株質(zhì)粒上的KPC基因。

材料和方法

一、菌株和質(zhì)粒

肺炎克雷伯菌HS062105(ST423型)來(lái)自華山醫(yī)院2006年8月從尿標(biāo)本中分離到的臨床菌株，肺炎克雷伯菌HS082416(ST11型)于2009年10月從痰標(biāo)本中分離。質(zhì)粒 pKOBEG-Apr、pMQ300來(lái)自于英國(guó)Leicester大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

二、主要儀器和試劑

Bio-tech公司生產(chǎn)的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀、電導(dǎo)入儀、離心機(jī)，抗菌藥物氨芐西林(ampicillin，AMP)、頭孢噻肟(cefotaxime，CTX)、頭孢他啶(ceftazidime，CAZ)、亞胺培南(imipenem，IMP)、美羅培南(meropenem，MEM)和厄他培南(ertapenem，ETM)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，血瓊脂平板購(gòu)自上?？片敿紊镉邢薰?，菌株的分離與鑒定使用法國(guó)生物梅里埃公司全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)VITEK-Compect，PCR試劑購(gòu)自大連寶生物TaKaRa公司。引物合成由上海英駿生物有限公司完成，電泳結(jié)果分析使用Tanon2500數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)。

三、同源重組片段的制備和純化

以試驗(yàn)臨床菌株質(zhì)粒為模板，SOE1、SOE2和SOE5、SOE6為引物，質(zhì)粒pMQ300為模板，SOE3、SOE4為引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，見(jiàn)表1，得到PCR產(chǎn)物TS1、TS2和hph，然后以PCR產(chǎn)物TS1及hph為模板，SOE1、SOE4為引物進(jìn)行重疊延伸基因擴(kuò)增(gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction，SOE-PCR)，得到產(chǎn)物TS1-hph，再以 TS1-hph為模板，以 SOE1、SOE6為引物進(jìn)行SOE-PCR即可得到產(chǎn)物TS1-hph-TS2。經(jīng)鑒定的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化并測(cè)定DNA濃度，試驗(yàn)過(guò)程見(jiàn)圖1[1-3]。

表1 試驗(yàn)引物

圖1 λ red同源重組片段的構(gòu)建示意圖

四、λ red重組功能的誘導(dǎo)

1.λ red依托質(zhì)粒pKOBEG-Apr電轉(zhuǎn)化進(jìn)入試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)菌株制備成為感受態(tài)，取0.1 μg pKOBEG-APr質(zhì)粒DNA電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)后加入1 mL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60 min之后涂于含阿普霉素的LB平板上，30℃過(guò)夜。30℃過(guò)夜LB平板上生長(zhǎng)的單克隆即為含有λ red依托質(zhì)粒pKOBEG-Apr的試驗(yàn)菌株。

2.λ red重組蛋白的誘導(dǎo) 挑取30℃過(guò)夜LB平板上的單克隆，加入5 mL LB培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)，次日以1∶50的比例接種細(xì)菌至100 mL LB培養(yǎng)液中，30℃振蕩培養(yǎng)至吸光度(A)600值為0.2時(shí)，加入L-阿拉伯多糖至終濃度為0.1%，繼續(xù)30℃振蕩培養(yǎng)至A600值為0.6，在此期間exo/bet/gam蛋白在L-阿拉伯多糖的誘導(dǎo)下發(fā)生了短暫表達(dá)，將誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌制備成為感受態(tài)。

五、λ red重組

取0.2 μg帶有同源臂的融合片段(步驟3)電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(步驟5)，電轉(zhuǎn)后加入1 mL LB培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)60 min，最后取其中的100μL 涂于潮霉素(150 μg/mL)+ 阿普霉素(10 μg/mL)LB平板上，30℃過(guò)夜。30℃過(guò)夜LB平板上生長(zhǎng)的單克隆同時(shí)含有λ red依托質(zhì)粒pKOBEG-Apr和帶有同源臂的融合PCR產(chǎn)物，在λ red重組蛋白的誘導(dǎo)下，同源重組敲除試驗(yàn)菌株的blaKPC-2基因。

六、重組后鑒定

挑取數(shù)個(gè)單克隆至2 mL LB培養(yǎng)基中[潮霉素(150 μg/mL)+ 阿普霉素(10 μg/mL)]，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日提取質(zhì)粒 DNA，PCR擴(kuò)增blaKPC-2及hph基因。

七、目的基因完全去除的驗(yàn)證

抽提原試驗(yàn)菌株及重組后菌株RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR定量檢測(cè)blaKPC-2基因的表達(dá)量。

八、抗菌藥物敏感性試驗(yàn)

參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M07-A8，采用微量肉湯最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)法檢測(cè)野生株及 blaKPC-2缺陷突變株對(duì) AMP、CTX、CAZ、IMP、MEM 和 ETM 的敏感性。

結(jié) 果

一、同源重組片段的構(gòu)建

耐藥基因片段、上下游片段及融合片段電泳結(jié)果見(jiàn)圖2，泳道1～5為ST423型試驗(yàn)菌株各片段電泳圖，泳道6～10為ST11型試驗(yàn)菌株各片段電泳圖。

二、重組克隆株的篩選及確認(rèn)

野生株中blaKPC-2基因?yàn)殛?yáng)性，hph基因?yàn)殛幮?，而blaKPC-2缺陷突變株中blaKPC-2基因?yàn)殛幮?，hph基因?yàn)殛?yáng)性，即可確認(rèn)blaKPC-2缺陷突變株發(fā)生了同源重組，成功敲除了blaKPC-2基因，見(jiàn)圖3。

圖2 耐藥基因片段、上下游片段及融合片段電泳圖

圖3 原試驗(yàn)菌株(野生株)和重組克隆株(blaKPC-2缺陷突變株)中blaKPC-2和hph基因電泳圖

三、野生株及blaKPC-2缺陷突變株中blaKPC-2基因的表達(dá)水平

使用逆轉(zhuǎn)錄PCR，以HS08763作為參考菌株，野生株HS062105(ST423型)blaKPC-2基因表達(dá)量為參考菌株表達(dá)量的1.9倍，野生株HS082416(ST11型)blaKPC-2基因表達(dá)量為參考菌株表達(dá)量的 0.9倍。blaKPC-2缺陷突變株 ΔHS062105、ΔHS082416 blaKPC-2基因表達(dá)量檢測(cè)不出，說(shuō)明成功敲除了野生株blaKPC-2基因。

四、體外藥物敏感性試驗(yàn)

野生株 HS062105(ST423型)、HS082416(ST11 型)對(duì) AMP、CTX、CAZ、IMP、MEM、ETM均耐藥，blaKPC-2缺陷突變株 ΔHS062105對(duì) IMP、MEM敏感，ΔHS082416對(duì) IMP、MEM、ETM 敏感。見(jiàn)表2。

表2 野生株及blaKPC-2缺陷突變株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

討 論

傳統(tǒng)的同源重組敲除某特定基因需要多步亞克隆，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。λ red重組質(zhì)粒pKOBEG-Apr攜帶λ red，在L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)下可表達(dá)同源重組蛋白exo/bet/gam，介導(dǎo)電轉(zhuǎn)入的線(xiàn)性融合產(chǎn)物與相應(yīng)的基因發(fā)生同源重組，然后再用合適的抗菌藥物篩選，即可得到重組突變株，省時(shí)、省力。由于pKOBEG有一溫度敏感的復(fù)制起始位點(diǎn)，當(dāng)溫度高于37℃時(shí)，細(xì)菌將消除質(zhì)粒pKOBEG。不會(huì)對(duì)細(xì)菌后續(xù)研究造成干擾，是一種簡(jiǎn)單、高效的敲除方法。

泛耐藥菌株對(duì)幾乎所有臨床常用的抗菌藥物都耐藥，很難找到合適的耐藥標(biāo)記篩選特定的突變克隆株，造成臨床菌株的研究困難，進(jìn)展緩慢。潮霉素和阿普霉素廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)細(xì)菌學(xué)研究，未在臨床中使用。臨床菌株普遍對(duì)這2種藥物敏感，因此在臨床菌株中非常有用。

本研究選取了2006年8月至2009年12月分離的肺炎克雷伯菌 HS062105(ST423型)、HS082416(ST11型)，在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)，泛耐藥肺炎克雷伯菌快速播散，臨床分離菌株數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)，并由ST423型轉(zhuǎn)變?yōu)槎玖Ω叩腟T11型。研究耐藥基因水平傳播的機(jī)制，此時(shí)間節(jié)點(diǎn)分離到的泛耐藥肺炎克雷伯菌最具代表性。我們成功地用FKPCU-Hyg-FKPCD片段替換了細(xì)菌的KPC基因，克隆證實(shí)突變菌株KPC(-)、Hyg(+)，藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示菌株敲除KPC基因后對(duì)IMP、MEM和ETM敏感，而菌株HS062105(ST423型)僅對(duì)IMP和MEM敏感，ETM仍耐藥。究其原因是HS062105(ST423型)、HS082416(ST11型)還產(chǎn)生CTXM-14及SHV-12，因此對(duì)CAZ、CTX等仍耐藥，HS062105(ST423型)對(duì)ETM仍耐藥是因?yàn)樵摼赀€產(chǎn)生一種頭孢菌素酶，有文獻(xiàn)報(bào)道高表達(dá)頭孢菌素酶加上膜孔蛋白缺陷可導(dǎo)致菌株對(duì)ETM 耐藥[4]。

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