郭秀全 張惠芳 王養(yǎng)民 呂海迪 李衛(wèi)平 喬夠梅 郭 婭

自噬參與急性腎損傷(AKI)臨床病理過程，然而直到現(xiàn)在人們對(duì)自噬與AKI之間的聯(lián)系了解甚少［1］?，F(xiàn)在有越來越多的證據(jù)表明，自噬是在AKI的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要的角色，但是目前對(duì)自噬在AKI的發(fā)病過程中的具體作用機(jī)制的研究仍處在起步階段［2］。本研究通過研究Beclin－1在急性腎損傷腎組織中的表達(dá)，初步探討自噬在AKI發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料與方法

1．動(dòng)物和試劑:成年雄性SD大鼠，蘭州軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量250±30g;動(dòng)物清潔度為Ⅱ級(jí)，自由飲食，室溫12h∶12h晝夜節(jié)律下飼養(yǎng)。主要試劑:兔抗Beclin－1多克隆抗體、即用型SP免疫組化檢測(cè)試劑、DAB顯色試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司，余為國(guó)內(nèi)公司標(biāo)準(zhǔn)品。

2．SD大鼠急性腎損傷模型的建立:選用24只雄性大鼠SD大鼠，體重250±30g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組:(1)假手術(shù)組(Sham組，n=12):大鼠常規(guī)麻醉后行開腹手術(shù)，立即切除右腎用作正常腎臟標(biāo)本，游離左側(cè)腎蒂血管，不夾閉，觀察30min關(guān)閉腹部;(2)缺血－再灌注組(I/R組，n=12):切除右腎，左腎蒂血管分離，觀察30min后用無損傷動(dòng)脈夾持續(xù)夾閉左腎蒂血管45min后，恢復(fù)左腎血流，關(guān)閉腹部;術(shù)后12、24、48h 3個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收獲腎臟標(biāo)本。HE染色觀察腎臟病理變化，測(cè)定自噬相關(guān)蛋白Beclin－l的表達(dá)情況，透射電鏡觀察腎臟組織自噬現(xiàn)象。

3．樣品制備:大鼠在缺血－再灌注不同時(shí)間，斷頭處死取左側(cè)腎臟10%甲醛溶液中備用，右側(cè)放入2．5%的戊二醛溶液中做透射電鏡備用。

4．標(biāo)本HE染色病理切片觀察:大鼠處死以后立即10%甲醛常規(guī)灌注固定后常規(guī)石蠟包埋、切片、染色。

5．Beclin1蛋白表達(dá)測(cè)定:10%甲醛常規(guī)灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液(4℃)中過夜。蠟塊制作。切片、貼片。加入配好的0．3%的過氧化氫甲醇溶液30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響;加入配好的0．3%Triton×100 30min，以增加細(xì)胞的通透性，加入用血清稀釋液稀釋的一抗、二抗(1∶500)，加入顯色液，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，脫水之后，封片，拍照。

6．透射電鏡觀察自噬體:①2．5%戊二醛固定;②0．1mol/L PBS漂洗兩次，10分鐘/次;③1%鋨酸后固定2h;④丙酮梯度脫水;⑤環(huán)氧樹脂618包埋;⑥半薄切片定位;⑦超薄切片，鈾染，鉛染;⑧電鏡觀察，拍照。

結(jié) 果

1．HE染色病理:I/R組大鼠造模后腎組織切片HE染色顯示部分腎小球逐漸萎縮，球囊腔出現(xiàn)空隙，球囊腔空隙增大明顯，毛細(xì)血管攀萎縮，腎小管上皮細(xì)胞變性。隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，腎小球縮小較前更為明顯，球囊腔更大，腎小管上皮細(xì)胞變性顯著，但未見明顯的出血，未見小球滲出病變。對(duì)照組大鼠腎組織切片顯示腎小球無明顯萎縮、球囊腔不明顯，腎小管細(xì)胞排列規(guī)則，腎小血管開放良好(圖1)。

圖1 12、24、48h 腎組織病理切片(HE，×200)

2．免疫組化:Beclin1在對(duì)照組可見腎小管表達(dá)，正常腎小球未見明顯表達(dá)。在I/R組腎組織中腎小管及腎小球均可見表達(dá)，且表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，其中12h表達(dá)弱于24h，48h表達(dá)最強(qiáng)(P＜0.05，圖2)。陰性對(duì)照未見棕黃色顆粒沉積。

圖 2 12、24、48h 腎組織免疫組化(×100)

3．透射電鏡:透射電鏡結(jié)果可見I/R組大鼠腎組織內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，在腎小管細(xì)胞部分區(qū)域可見大量次級(jí)溶酶體，內(nèi)有深染區(qū)域。內(nèi)織網(wǎng)改變不明顯，I/R組造模后在透射電鏡下可見損傷的細(xì)胞器如線粒體的腫脹變性，其周圍出現(xiàn)空泡狀雙層膜樣結(jié)構(gòu)、繼而雙層膜環(huán)繞成自噬體、進(jìn)而與溶酶體融合、消化，也可見自噬溶酶體內(nèi)最終不能降解的殘?bào)w等(圖3)。對(duì)照組大鼠腎組織可偶見帶有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡樣結(jié)構(gòu)，主要位于腎小管區(qū)，數(shù)量較少。

討 論

圖3 透射電鏡見腎組織中自噬體

自噬是參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大分子物質(zhì)和細(xì)胞器降解的一種高度保守的生理行為［3］，其一般通過雙層膜結(jié)構(gòu)包裹待降解物質(zhì)形成自噬體，轉(zhuǎn)運(yùn)其至溶酶體并與之結(jié)合形成自噬溶酶體而降解。細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，自噬可通過把衰老的細(xì)胞器等廢物降解成合成細(xì)胞最基本的元素重新利用，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［4］。不同于泛素－蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)，自噬的吞噬是沒有選擇性的，在人體發(fā)育過程可清除有害和過剩的細(xì)胞器及病原體，有利于細(xì)胞組織的重塑［5］。到目前為止，已知自噬的作用機(jī)制過程包括:①由雙層膜結(jié)構(gòu)始發(fā);②雙層膜結(jié)構(gòu)的擴(kuò)張延伸;③分化成熟成為自噬小體;④與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體;⑤包裹攝入物質(zhì)的降解［6］。

AKI是由導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)或功能變化的損傷引起的腎功能突然(≤48h)下降，涵蓋了從腎功能的輕微受損到需要進(jìn)行腎臟替代治療的嚴(yán)重病變，是一個(gè)嚴(yán)重的疾病譜。急性腎損傷的特點(diǎn)是腎小球?yàn)V過率的降低，導(dǎo)致含氮廢物如尿素氮等的積累以及電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂，導(dǎo)致腎功能的喪失［7］。此外，AKI的發(fā)病率近年來有所增加，越來越多的患者需要采用腎臟替代療法，這也進(jìn)一步醫(yī)療系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)。

Chang等［8］發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注大鼠腎小管中自噬相關(guān)基因(ATG)蛋白Beclin－1和LC3表達(dá)增加，發(fā)現(xiàn)腎組織在此病理?xiàng)l件下自噬被激活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人腎近端小管細(xì)胞株(HK－2)缺氧后大批LC3和LAMP2陽(yáng)性液泡生成，在大鼠腎臟缺血－再灌注期間也有明顯增多。LC3陽(yáng)性液泡與LAMP2陽(yáng)性液泡增殖提示自噬小體與溶酶體為降解而產(chǎn)生了融合。通過電子顯微鏡(EM)在腎臟移植患者的小管細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)自噬小體。再灌注壓力促進(jìn)活性氧的釋放，增加缺血性壓力和導(dǎo)致所謂的缺血再灌注(IR)損傷，IR損傷激活自噬［9］。事實(shí)上，氧化應(yīng)激上調(diào)包括Beclin－1和LC3在內(nèi)的自噬表達(dá)從而促進(jìn)自噬。這為上調(diào)自噬在治療腎損傷提供了前景和方向。含BCL2L1 cDNA重組人類腺病毒在缺血前動(dòng)脈灌注可通過通過抑制細(xì)胞凋亡和自噬保護(hù)腎臟腎缺血再灌注損傷，BCL2L1可抑制線粒體外膜透化作用和活性氧的生產(chǎn)［10］。此外BCL2L1增強(qiáng)減少急性腎小管壞死和改善腎功能不全。

BCL2L1或BCL2/Bcl－xl在AKI患者腎小管細(xì)胞自噬中的抑制作用一直在被研究。在大鼠缺血再灌注后含Bcl2l1基因的血液可減少自噬的發(fā)生，在這種情況下通過 GFP－LC3 BCL2雙轉(zhuǎn)基因小鼠BCL2也可抑制自噬的發(fā)生，順鉑誘導(dǎo)自噬被BCL2完全抑制［11］。自噬是BCL2－BCL2L1通過BCL2同調(diào)因子3(BH3)結(jié)構(gòu)域結(jié)合Beclin－1來抑制Beclin－1在Ⅲ類PtdIns3K復(fù)合體上組裝，且只有具有ER靶點(diǎn)的 BCL2可抑制自噬，這是公認(rèn)的 BCL2－BCL2L1調(diào)節(jié)自噬的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)表明，營(yíng)養(yǎng)剝奪自噬因子1(NAF1)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中結(jié)合BCL2通過Beclin－1、BCL2之間的相互作用抑制自噬［12］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的BCL2除了聯(lián)合Beclin－1，也可以通過減少應(yīng)激激活Ca2+的釋放和順向鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶AMPK的信號(hào)通路抑制自噬［13］。

研究也發(fā)現(xiàn)AKI中小管細(xì)胞自噬可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Lai等在大鼠的腎臟缺血－再灌注實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在損傷的腎小管中Beclin－1和LC3表達(dá)以及細(xì)胞凋亡表達(dá)同時(shí)增加。自噬和凋亡均能被BCL2L1過表達(dá)或缺血性預(yù)處理所抑制，同時(shí)腎損傷的程度得到改善［14］。Suzuki等發(fā)現(xiàn)GFP－LC3轉(zhuǎn)基因小鼠腎缺血－再灌注后腎小管中自噬小體的形態(tài)發(fā)生變化，而且伴隨BCL2－GFP－LC3雙轉(zhuǎn)基因小鼠中自噬減少，腎小管的損傷也相應(yīng)減輕，在體外觀察到自噬抑制劑對(duì)H2O2引起的HK2細(xì)胞死亡具有保護(hù)作用說明在腎缺血－再灌注自噬可能是有害的。Gozuacik等研究發(fā)現(xiàn)ER應(yīng)激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡和自噬在相同的小管細(xì)胞產(chǎn)生同等的損傷，自噬本身的抑制并不能改變細(xì)胞死亡或生存的狀態(tài)。Dapk1基因敲除小鼠因自噬受到抑制使其對(duì)ER應(yīng)激導(dǎo)致的腎小管細(xì)胞損傷不耐受。因此自噬可作為在ER應(yīng)激中協(xié)同細(xì)胞凋亡引起腎損傷的第2個(gè)細(xì)胞損傷機(jī)制。

哺乳動(dòng)物自噬調(diào)控基因 Beclin 1是酵母 ATG6的同系物，1998年Beth等在酵母的雜交克隆篩選中得到，是自噬過程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)分子，它通過與磷酸肌醇3激酶(PI3K)結(jié)合而參與早期自噬的調(diào)節(jié)，參與自噬體的形成及調(diào)節(jié)其他自噬蛋白在自噬前體膜的定位［15］。Beclin－1參與早期的自噬，促進(jìn)自噬小泡的成核和從細(xì)胞溶質(zhì)招募蛋白質(zhì)，是自噬體形成的標(biāo)志。Beclin 1通過與 PI3K、Vps34形成復(fù)合體，此過程需要VMP1－AtgD的參與，使磷脂酰肌醇磷酸化，在自噬小體膜上產(chǎn)生三磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)。PI3P在自噬前體復(fù)合物的形成及自噬小體膜的來源中發(fā)揮重要作用［16］。Beclin－1在誘導(dǎo)自噬發(fā)生時(shí)形成的復(fù)合物中，除 Vps34外還包括UVRAG、Ambra1和Bif－1。VMP1表達(dá)可誘導(dǎo)自噬，并且這種跨膜蛋白的表達(dá)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬形成必不可少的。VMP1表達(dá)誘導(dǎo)的自噬是通過VMP1－AtgD和Beclin－1－BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合而介導(dǎo)的。這導(dǎo)致自噬體形成位點(diǎn)Ⅲ類PI3K的定位。VMP1－AtgD結(jié)構(gòu)域與Beclin－1、BH3結(jié)合可促進(jìn)其取代自噬負(fù)調(diào)節(jié)因子bcl 2位點(diǎn)，促進(jìn)Beclin－1進(jìn)入自噬途徑。本研究結(jié)果顯示大鼠腎組織對(duì)照組Beclin－1染色表達(dá)較空白明顯增強(qiáng)。

最近的發(fā)現(xiàn)為Beclin－1存在于的Ⅲ類PI3K復(fù)合體上提供了生化證據(jù)。Beclin－1復(fù)合體參與自噬作用機(jī)制的不同時(shí)期，而且每個(gè)復(fù)合體的核心都由Beclin－1、hVps34、hVps15組成，Beclin1－h(huán)Vps34復(fù)合體控制自噬小體的形成。VMP1－Beclin－1之間的相互作用是哺乳動(dòng)物自噬VMP1－Beclin－1－h(huán)Vps34復(fù)合體形成所必需的。VMP1－Beclin－1復(fù)合體可促進(jìn)自噬小體膜上生成。然而，雷帕霉素干預(yù)或VMP1過表達(dá)促進(jìn)自噬體形成位點(diǎn)PI3P的生成。VMP1－Beclin－1通過VMP1－AtgD的相互作用是哺乳動(dòng)物自噬需要的PI3K活性的定位所必需的。

本研究中，在缺血再灌注誘導(dǎo)急性腎損傷腎組織中隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，急性腎損傷程度的加重，自噬蛋白Beclin－1表達(dá)明顯增多，提示急性腎損傷腎組織中發(fā)生了自噬，文獻(xiàn)報(bào)道自噬在AKI損傷中對(duì)腎小管細(xì)胞具有保護(hù)作用，通過自噬的研究可為AKI的預(yù)防及治療提供了一個(gè)新的方向和思路，進(jìn)一步的研究可能為AKI的預(yù)防和治療開辟一個(gè)新的領(lǐng)域。

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