姚榮欣，李欠欠，林穎，周謝敏，包云華

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325027；2.耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理科，New Haven，Connecticut，06520）

細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-11（IL-11）由人類(lèi)骨髓基質(zhì)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有報(bào)道使用IL-11治療免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）取得了較好的效果[1-6]，但其機(jī)制不明。本研究觀察ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）在體外加入IL-11培養(yǎng)后Th1、Th2細(xì)胞比例及T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的改變，探討IL-11治療ITP的作用機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2011年6月-2012年8月在本院住院的ITP患者10例，均符合下列條件：首次發(fā)病者院外未應(yīng)用過(guò)丙種球蛋白、糖皮質(zhì)激素；ITP復(fù)發(fā)者近半年未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素；近4周無(wú)感染及其他急慢性疾??；無(wú)過(guò)敏和免疫性疾病史及家族史。其中男4例，女6例，平均年齡（32.8±9.4）歲。

1.2 試劑與儀器 IL-11（巨和粒）購(gòu)自山東齊魯制藥廠；CD3 PerCP、IL-4 PE、IFN-γAPC、CD8 FITC、IGG1 PE、IGG1 APC、CD69 PE（BD Biosciences，美國(guó)）；BFA、PMA、離子霉素（Sigma，美國(guó)）；人淋巴細(xì)胞分離液（TBD，天津）；胎牛血清（四季青，杭州）；RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibco，美國(guó)）；Trizol（Invitrogen，美國(guó)）；MBI RT試劑盒（Fermentas，加拿大）；Roche SYBR Green I染料（Roche，瑞士）；BD FACS Canto II流式細(xì)胞儀（BD Biosciences，美國(guó)）；Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）；酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PBMC分離：無(wú)菌抽取每例ITP患者外周靜脈血10 mL，肝素抗凝，用PBS液1:1稀釋后，用密度梯度離心法分離PBMC，錐蟲(chóng)藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞活率大于95%。

1.3.2 加IL-11后細(xì)胞培養(yǎng)：PBMC用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度（分別加入100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素+100 U/mL IL-2）至6×107個(gè)細(xì)胞/mL，各取1 mL分裝于6孔板內(nèi)中，編號(hào)1、2、3、4、5，分別加入IL-11 0、25、50、100及200 ng。放入37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱內(nèi)，培養(yǎng)4 d，錐蟲(chóng)藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞活率大于95%。

1.3.3 Th1、Th2細(xì)胞測(cè)定：將培養(yǎng)4 d后每孔細(xì)胞懸液分別取培養(yǎng)液200 L，用流式細(xì)胞儀測(cè)CD4+T細(xì)胞Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞比例。采用CD3與CD8反射門(mén)選取CD4+T細(xì)胞，即以CD3+CD8-IFN-γ+（APC標(biāo)記IFN-γ）標(biāo)記Th1，以CD3+CD8-IL-4+（PE標(biāo)記IL-4）標(biāo)記Th2，因Th1、Th2分群不明顯，應(yīng)用CD3+CD8-IFN-γ-及CD3+CD8-IL-4-作為陰性對(duì)照，設(shè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)小于0.1%作為陰性閾值，在陰性閾值基線基礎(chǔ)上計(jì)數(shù)CD3+CD8-IFN-γ+細(xì)胞及CD3+CD8-IL-4+細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞群中Th1、Th2細(xì)胞所占百分比，并計(jì)算Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞比值（Th1/Th2）。

1.3.4 T-bet mRNA、GATA-3 mRNA檢測(cè)：培養(yǎng)4 d后每孔細(xì)胞懸液取1×106，采用Trizol試劑提取總RNA，采用Tecan酶標(biāo)儀測(cè)量其濃度和純度，用瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。取總RNA 1μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Green I染料檢測(cè)T-bet mRNA、GATA-3 mRNA表達(dá)情況。引物序列見(jiàn)表1，以GAPDH作為內(nèi)參基因，每個(gè)標(biāo)本分別進(jìn)行T-bet、GATA-3、GAPDH的檢測(cè)。反應(yīng)條件：熱啟動(dòng)95 ℃ 5 min；擴(kuò)增（95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，60 ℃采集熒光信號(hào)一次）連續(xù)45個(gè)循環(huán)；熔解95 ℃ 15 s，65 ℃15 s，升溫到95 ℃的同時(shí)連續(xù)檢測(cè)熒光信號(hào)。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)設(shè)3個(gè)副孔。所有的PCR產(chǎn)物均經(jīng)熔解曲線分析以分辨目的產(chǎn)物與非特異產(chǎn)物以及引物二聚體。質(zhì)控：加一個(gè)空白管，用雙蒸水替代cDNA。以Target/Ref進(jìn)行相對(duì)定量，即分別以T-bet/GAPDH和GATA-3/GAPDH表示T-bet mRNA、GATA-3 mRNA表達(dá)量。并計(jì)算T-bet mRNA與GATA-3 mRNA的比值。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件作數(shù)據(jù)處理。檢測(cè)指標(biāo)以 ±s描述，多組間均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4+T細(xì)胞Th1、Th2流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果 ITP患者PBMC加入不同濃度的IL-11培養(yǎng)后，對(duì)各組間Th1、Th2比例及Th1/Th2分別進(jìn)行單因素方差分析（方差齊性檢驗(yàn)P＞0.1），結(jié)果顯示P均小于0.05，說(shuō)明不同濃度IL-11對(duì)Th1、Th2比例及Th1/Th2比值的影響作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

當(dāng)IL-11濃度為100 ng/mL時(shí)，與濃度為0的對(duì)照組比較差異最大，表現(xiàn)為T(mén)h1比例及Th1/Th2比值下降，Th2比例升高（均P＜0.01）。具體數(shù)值見(jiàn)表2。

表2 各組Th1、Th2及Th1/Th2測(cè)定結(jié)果（n=10， ±s）

2.2 T-bet mRNA、GATA-3 mRNA RT-PCR測(cè)定結(jié)果

提取mRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳檢查，瓊脂凝膠電泳分析條帶明亮，無(wú)雜帶，說(shuō)明基因完整。目的基因T-bet mRNA、Gata-3 mRNA及內(nèi)參基因GAPDH mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后可見(jiàn)3個(gè)副孔重復(fù)性好，曲線上升期明顯，拐點(diǎn)清楚，基線平，可見(jiàn)平臺(tái)期，表明擴(kuò)增良好。擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線均為單峰，說(shuō)明引物良好，提取的mRNA完整。

對(duì)各濃度組間T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3分別進(jìn)行單因素方差分析（方差齊性檢驗(yàn)P＞0.1），結(jié)果顯示P均小于0.05，說(shuō)明不同濃度IL-11對(duì)T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3的影響作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

當(dāng)IL-11濃度為100 ng/mL時(shí)，與濃度為0的對(duì)照組相比，T-bet mRNA表達(dá)下降，GATA-3 mRNA表達(dá)增加，T-bet/GATA-3比值顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。具體數(shù)值見(jiàn)表3。

表3 各組T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3檢測(cè)結(jié)果（n=10， ±s）

3 討論

IL-11主要由間充質(zhì)來(lái)源的黏附細(xì)胞產(chǎn)生，具有多種生物活性，在免疫調(diào)節(jié)、造血調(diào)控方面具有重要作用。目前的研究認(rèn)為IL-11能促進(jìn)Th1細(xì)胞向Th2亞群分化[7-10]。

CD4+的T細(xì)胞在抗原的刺激下，分化為中間狀態(tài)的Th0細(xì)胞，進(jìn)而在不同的微環(huán)境條件下，分化為T(mén)hl和Th2類(lèi)細(xì)胞。由于Th1、Th2細(xì)胞缺乏特異的細(xì)胞表面抗原標(biāo)記，目前一般通過(guò)檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4水平來(lái)作為其各自的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀以CD3、CD8反射門(mén)選取CD4+T細(xì)胞，Thl細(xì)胞應(yīng)用IFN-γ APC熒光抗體標(biāo)記，Th2細(xì)胞應(yīng)用IL-4 PE熒光抗體標(biāo)記，通過(guò)測(cè)定CD4+T細(xì)胞中IFN-γ、IL-4來(lái)確定Thl、Th2細(xì)胞百分率。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)ITP患者PBMC在加入IL-11培養(yǎng)后，Th1細(xì)胞比例下降，Th2細(xì)胞比例升高，Th1/Th2比值下降，這種現(xiàn)象在IL-11濃度為100 ng/mL時(shí)最為明顯，表明IL-11在體外培養(yǎng)條件下能促使ITP患者PBMC由Th1細(xì)胞極化向Th2細(xì)胞極化漂移。作為自身免疫性疾病，成人慢性ITP具有特異表達(dá)Th1極化以及Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平升高現(xiàn)象[11-12]?，F(xiàn)有研究表明CD4+T細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞亞群比例失衡是ITP發(fā)病的機(jī)制之一[13-17]，由此我們推測(cè)，通過(guò)促使CD4+T細(xì)胞更多地由Th1細(xì)胞極化向Th2細(xì)胞極化漂移，從而糾正ITP患者體內(nèi)存在的免疫失衡可能是IL-11在臨床上有效治療ITP的機(jī)制之一。

T-bet和GATA-3是調(diào)節(jié)Th1和Th2類(lèi)細(xì)胞因子表達(dá)的兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[18-21]。T-bet是轉(zhuǎn)錄因子T-box家族成員之一，表達(dá)于包括骨髓、臍血祖細(xì)胞及干細(xì)胞在內(nèi)的血細(xì)胞，主要為CD4+T細(xì)胞。T-et通過(guò)激活I(lǐng)FN-γ基因而發(fā)揮其對(duì)Th1細(xì)胞發(fā)育的正性調(diào)控作用，其高表達(dá)與Th1型細(xì)胞因子細(xì)胞的升高相符合。將T-bet基因反轉(zhuǎn)錄于成熟的Th2細(xì)胞能促使其轉(zhuǎn)化為分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞，并同時(shí)抑制IL-4、IL-5等細(xì)胞因子的表達(dá)，因此，T-bet在促使Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞極化的同時(shí)明顯抑制了Th2細(xì)胞的極化[22]。T-bet的表達(dá)在Th1細(xì)胞發(fā)展的早期階段明顯增高，但是在Th2細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中并不表達(dá)。GATA-3是鋅指蛋白GATA家族的成員之一，在促進(jìn)Th2細(xì)胞形成和抑制Th1細(xì)胞形成過(guò)程中起核心作用。CD4+T細(xì)胞僅表達(dá)低水平的GATA-3，當(dāng)CD4+T細(xì)胞向Th2分化時(shí)該表達(dá)上調(diào)，而當(dāng)CD4+T細(xì)胞向Thl分化時(shí)該表達(dá)下調(diào)，在成熟Thl細(xì)胞中則不能被測(cè)到，故GATA-3僅特異表達(dá)于Th2細(xì)胞。此外，GATA-3既可抑制Thl細(xì)胞分化，亦可促使其向Th2細(xì)胞的極化方向發(fā)生改變，GATA-3在促使Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞極化的同時(shí)抑制了Thl細(xì)胞的極化[23]。在自身免疫性疾病和移植物抗宿主病中，可以觀察到T-bet上升和GATA-3下降現(xiàn)象[24-25]。

Chakir等[26]發(fā)現(xiàn)，在多種產(chǎn)生Th1樣和Th2樣細(xì)胞因子的細(xì)胞中，T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表達(dá)上調(diào)，并且可以比較容易地從混合細(xì)胞群中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR的方法測(cè)定，這提示T-bet/GATA-3可以在許多種情況下反映Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡狀況。

我們采用RT-PCR技術(shù)，從轉(zhuǎn)錄水平上測(cè)定Th1、Th2細(xì)胞的調(diào)控因子T-bet mRNA、GATA-3 mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ITP患者的PBMC經(jīng)IL-11培養(yǎng)后，T-bet mRNA表達(dá)下降，而GATA-3 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，T-bet mRNA/GATA-3 mRNA比值下降。

綜上所述，我們分別通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定Th1、Th2細(xì)胞比例及Th1/Th2比值和RT-PCR方法測(cè)定Th1、Th2細(xì)胞的調(diào)控基因T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表達(dá)，從不同的角度表明，IL-11在體外能促使ITP患者CD4+T細(xì)胞從Th1極化優(yōu)勢(shì)向Th2極化優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化，這種轉(zhuǎn)化可能是通過(guò)其調(diào)控基因T-bet mRNA和GATA-3 mRNA來(lái)控制的。這可能是IL-11有效治療ITP的機(jī)制之一。

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