韓 杰，邊連全，劉顯軍，張 飛

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866

受免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟以及斷奶引發(fā)的斷奶應(yīng)激的影響，仔豬特別容易受到環(huán)境中病原微生物的侵襲而發(fā)生免疫應(yīng)激，免疫應(yīng)激使仔豬在行為上表現(xiàn)為嗜睡、采食量減少;代謝上則使機(jī)體將用于生長的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)向用于參與免疫防御，最終導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)生長抑制［1］。由于長期添加抗生素促生長劑引發(fā)的畜禽產(chǎn)品安全和人體健康等問題，禁止在畜禽生產(chǎn)中使用抗生素的呼聲越來越高，開發(fā)綠色環(huán)保型飼料添加劑具有重要意義。刺五加多糖(Acanthopanax senticosuspolysaccharide，ASPS)是從傳統(tǒng)中草藥刺五加中分離出的生物大分子多糖，其在體內(nèi)、外對人類和嚙齒類動物的免疫調(diào)節(jié)活性已經(jīng)被一些研究所證實。但在斷奶仔豬飼料中添加ASPS調(diào)節(jié)仔豬生長和免疫功能的研究鮮有報道。我們課題組前期的研究表明飼料添加ASPS 能緩解免疫應(yīng)激仔豬的生長抑制，改善斷奶仔豬的免疫機(jī)能［2］，但ASPS 調(diào)解斷奶仔豬免疫功能的作用機(jī)制尚不清楚。本試驗在前期研究基礎(chǔ)上，通過體外培養(yǎng)仔豬外周血淋巴細(xì)胞，從淋巴細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的角度初步探討ASPS 影響仔豬免疫功能的作用機(jī)制，旨在為ASPS 這種綠色飼料添加劑在養(yǎng)豬生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論參考資料。

1 材料與方法

1.1 不同濃度刺五加多糖溶液的配制

取刺五加根，采用熱水浸提乙醇分級沉淀工藝提取，苯酚-硫酸法測得多糖純度為92.7%。氣相色譜表明該多糖主要由葡萄糖和半乳糖組成。稱取320 mg ASPS 溶解于適量含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)液中，用5% NaHCO3調(diào)pH 至7.2～7.4，定容至100 mL 容量瓶中，0.22 μm 濾器過濾除菌，配制成含3.2 mg/mL ASPS RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。臨用前取1 mL 上述ASPS 細(xì)胞培養(yǎng)液，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)液分別稀釋至8、4、2、1 mL，配制成濃度分別為400、800、1600、3200 μg/mL ASPS 細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2 體外培養(yǎng)細(xì)胞的來源

取自1 頭28 d 斷奶、體重約8 kg 的健康仔豬的外周血。

1.3 外周血淋巴細(xì)胞懸液的制備及T、B 淋巴細(xì)胞的分離

取2 mL 肝素抗凝全血與生理鹽水1∶1 混勻后，緩緩加入4 mL 淋巴細(xì)胞分離液，2000 rpm 離心20 min，取乳白色淋巴細(xì)胞層約0.6 mL，加入5 mL RPMI-1640 完全培養(yǎng)液混勻，2000 rpm 離心20 min，沉淀經(jīng)2 次離心洗滌后即得所需的淋巴細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于RPMI-1640 完全培養(yǎng)液中，用0.5%臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)(＞95%)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×106個/mL。T、B 淋巴細(xì)胞的分離參照高巍等(2007)方法［3］。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 淋巴細(xì)胞增殖試驗

取0.08 mL T 細(xì)胞懸液含Con A(終濃度為5 mg/L)或B 細(xì)胞懸液含LPS(終濃度為20 mg/L)，加入到96 孔平底培養(yǎng)板中，再加入預(yù)先稀釋成不同濃度的ASPS 溶液0.01 mL、RPMI-1640 完全培養(yǎng)液0.01 mL，使培養(yǎng)體系A(chǔ)SPS 終濃度分別為0、40、80、160、320 μg/mL，每組設(shè)5 個重復(fù)。將細(xì)胞板置于5%、37 ℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前6 h，每孔加入10 μL MTT(初始濃度為5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)束每孔加入80 μL 10% SDS-0.04 mol/L HCl溶液再培養(yǎng)2 h，使紫色結(jié)晶完全溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀測定570 nm 波長OD 值。

1.4.2 白細(xì)胞介素-2(IL-2) 和白細(xì)胞介素-4(IL-4)的測定

將淋巴細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，步驟同1.4.1淋巴細(xì)胞增殖試驗，在培養(yǎng)的第24、48 和72 h，取上清液用IL-2 和IL-4 試劑盒(美國R＆D)測定。

1.4.3 T 淋巴細(xì)胞分泌可誘導(dǎo)一氧化氮合成酶(iNOS) 水平測定

96 孔平底培養(yǎng)板中每孔加入含Con A(終濃度為5 mg/L)的T 細(xì)胞懸液0.08 mL、0.01 mL anti-TLR4(初始濃度為50 μg/mL)，孵育1 h 后加入不同濃度ASPS 溶液0.01 mL，使培養(yǎng)體系A(chǔ)SPS 終濃度分別為0、40、80、160、320 μg/mL，置細(xì)胞板于5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，取上清液用iNOS 試劑盒(美國R＆D)測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 淋巴細(xì)胞分泌NO 的測定

細(xì)胞培養(yǎng)同1.4.3，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取50 μL 上清液加入等體積Greiss 試劑反應(yīng)20 min，測定550 nm OD 值。將6.9 mg NaNO2溶于1000 mL 雙蒸水中，分別取200、160、120、80、40、20、10、0 μL 于酶標(biāo)板中，再對應(yīng)分別加入0、40、80、120、160、180、190、200 μL Greiss 試劑反應(yīng)20 min 后測定550 nm OD 值。以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB) 活性和腫瘤壞死因子α(TNF-α) 的測定

細(xì)胞板加樣同iNOS 的測定，將加樣后的細(xì)胞板置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測定采用NF-κB 和TNF-α 試劑盒(美國R＆D)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 初步處理后，采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件的ANOVA 進(jìn)行不同處理間的單因素方差分析，采用Ducan 法進(jìn)行多重比較檢驗，以P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺五加多糖對外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

由圖1 可知，ASPS 顯著提高了仔豬外周血T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(P＜0.05)。與對照組相比，較高劑量的ASPS(160、320 μg/mL)顯著促進(jìn)了T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(P＜0.05)，而低劑量的ASPS(40、80 μg/mL)對T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率無顯著影響(P＞0.05);不同濃度的ASPS 對體外培養(yǎng)的仔豬外周血B 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均無顯著影響(P＞0.05)。

圖1 刺五加多糖對體外培養(yǎng)的仔豬外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響(n=5)Fig.1 Effect of ASPS on lymphocytes proliferation of cultured peripheral blood of weaned pigs (n=5)

2.2 刺五加多糖對淋巴細(xì)胞分泌IL-2 和IL-4 水平的影響

由表1 可知，在作用第24 和48 h，ASPS 處理雖使仔豬外周血淋巴細(xì)胞IL-2 產(chǎn)生量顯著增加(P＜0.05)，但與對照組相比，只有160 μg/mL 和320 μg/mL ASPS 處理組達(dá)到了顯著水平(P＜0.05);在作用第72 h 時，ASPS 處理顯著提高了淋巴細(xì)胞IL-2 的分泌量，并呈二次的劑量依賴關(guān)系(P＜0.05)。在作用第24、48 和72 h，ASPS 處理對體外培養(yǎng)的仔豬外周血淋巴細(xì)胞分泌IL-4 的影響均不顯著(P＞0.05)。

表1 刺五加多糖對體外培養(yǎng)的仔豬外周血淋巴細(xì)胞分泌IL-2 和IL-4 的影響(n=5)Table 1 Effect of ASPS on the concentration of IL-2 and IL-4 secreted by cultured peripheral blood lymphocytes of weaned pigs (n=5)

2.3 刺五加多糖對淋巴細(xì)胞分泌TNF-α、NO、iNOS和NF-κB 水平的影響

由表2 可知，當(dāng)培養(yǎng)體系無TLR4 抗體時，ASPS處理對淋巴細(xì)胞分泌TNF-α、NO、iNOS 和NF-κB 水平有顯著影響(P＜0.05)。與對照組比較，40、80、160、320 μg/mL ASPS 處理顯著提高了淋巴細(xì)胞分泌iNOS 水平(P＜0.05)，160 μg/mL ASPS 組仔豬外周血淋巴細(xì)胞iNOS 分泌量最高。40、80、160 μg/mL ASPS 顯著增加了淋巴細(xì)胞NF-κB 分泌水平(P＜0.05)。80、160 μg/mL ASPS 顯著增加了淋巴細(xì)胞分泌TNF-α 的水平(P＜0.05)。當(dāng)培養(yǎng)體系含TLR4 抗體時，不同濃度ASPS 對淋巴細(xì)胞TNF-α、iNOS 和NF-κB 的分泌量均無顯著影響(P＞0.05)。

表2 刺五加多糖對體外培養(yǎng)的仔豬外周血淋巴細(xì)胞分泌iNOS、NO、NF-κB 和TNF-α 水平的影響(n=5)Table 2 Effect of ASPS on the concentration of iNOS，NO，NF-κB and TNF-α secreted by cultured peripheral blood lymphocytes of weaned pigs (n=5)

3 討論

淋巴細(xì)胞增殖是檢測淋巴細(xì)胞免疫功能的常用指標(biāo)之一，T 細(xì)胞受促分裂素Con A 刺激或B 細(xì)胞受LPS 刺激時的增殖情況在一定程度上可以分別反映細(xì)胞免疫和體液免疫的功能變化。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASPS 能協(xié)同Con A 促進(jìn)外周血T 細(xì)胞增殖但不能協(xié)同LPS 促進(jìn)B 細(xì)胞增殖，提示T 細(xì)胞可能是ASPS 作用的直接靶細(xì)胞之一。輔助性T 細(xì)胞(Th)作為T 細(xì)胞重要的亞型之一，其Th1 型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-2 能有效促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖、刺激細(xì)胞免疫和介導(dǎo)炎癥反應(yīng);Th2 型細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4 可促進(jìn)B 細(xì)胞增殖，刺激體液免疫，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生［4］。本研究發(fā)現(xiàn)ASPS 能促進(jìn)Thl 型細(xì)胞因子IL-2 的分泌而對Th2 型細(xì)胞因子IL-4 分泌無影響，此結(jié)果與以往曹麗等(2004)［5］和楊鐵虹等(2005)［6］的報道相似，提示了ASPS 可能通過作用于T 細(xì)胞分泌IL-2 影響機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。

NO 由淋巴細(xì)胞內(nèi)可誘導(dǎo)iNOS 催化生成，是在調(diào)節(jié)免疫功能上具有廣泛生物活性的信息分子。以往很多關(guān)于多糖影響iNOS 的報道表明多糖能促進(jìn)iNOS 基因表達(dá)，提高iNOS 活性進(jìn)而促進(jìn)NO 分泌，多糖提高iNOS 活性可能與激活NF-κB 因子有關(guān)［7］。侯敢等(2006)報道了蘆薈多糖能促進(jìn)小鼠Mφ NO 合成酶基因的表達(dá)，促進(jìn)NO 合成，用NF-κB抑制劑預(yù)先處理細(xì)胞，可抑制蘆薈多糖誘導(dǎo)的iNOS酶基因表達(dá)，表明蘆薈多糖促進(jìn)的NOS 基因表達(dá)與NF-κB 因子的激活有關(guān)［8］。本試驗表明，ASPS 顯著提高了體外培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)iNOS 水平、NO 分泌量和NF-κB 因子水平，160 μg/mL ASPS 組這些指標(biāo)的水平均為最高，提示NO 可能是ASPS 作用于仔豬外周血淋巴細(xì)胞的信息分子，同時，ASPS提高iNOS 水平可能與激活NF-κB 因子有關(guān)。

以往研究已經(jīng)證明了多糖調(diào)節(jié)免疫功能是通過首先與細(xì)胞表面受體結(jié)合介導(dǎo)免疫反應(yīng)［9］。TLR4受體是Toll 受體超家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員之一，多糖受TLR4 受體介導(dǎo)通過信號分子將胞外信號傳導(dǎo)至胞內(nèi)，使NF-κB 迅速從胞漿移位到胞核促進(jìn)細(xì)胞因子釋放，從而調(diào)節(jié)免疫功能［10］。Yoon 等(2003)在研究桔梗根多糖時發(fā)現(xiàn)TLR4 抗體預(yù)先與Mφ 作用能使NF-κB 迅速從胞漿移位到胞核與DNA結(jié)合，提示桔梗根多糖通過TLR4/NF-κB 通路起作用［9］。本試驗同Yoon 等(2003)的試驗結(jié)果相似。從本試驗結(jié)果看，培養(yǎng)體系中無TLR4 抗體時，淋巴細(xì)胞分泌TNF-α、NO、iNOS 和NF-κB 因子水平均顯著升高，但這種作用在培養(yǎng)體系中含TLR4 抗體時被抑制，提示TLR4 可能是ASPS 作用于淋巴細(xì)胞表面的受體之一，ASPS 通過TLR4 受體介導(dǎo)由NO 將細(xì)胞外信號傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，從而調(diào)節(jié)NF-κB 因子活性而促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α 的釋放，ASPS 影響淋巴細(xì)胞免疫功能與TLR4/NF-κB 信號傳導(dǎo)系統(tǒng)密不可分。

綜上所述，ASPS 能促進(jìn)體外培養(yǎng)的仔豬外周血T 細(xì)胞增殖和IL-2 的分泌，其作用可能是受到淋巴細(xì)胞表面受體TLR4 介導(dǎo)，通過TLR4/NF-κB 信號通路起作用。

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