徐 偉，丁章貴，李銘剛，文孟良，趙江源*

1云南大學(xué)云南省微生物研究所，昆明 650091;2 安徽省應(yīng)用技術(shù)研究院，合肥 230031

擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis，Meyer 1976 年提出［1］)微生物是一類高G +C 含量革蘭氏陽性好氧菌，廣泛分布于各種環(huán)境中，尤其在中度和高度鹽環(huán)境中呈優(yōu)勢微生物群落。擬諾卡氏屬目前已有個49個有效描述種［2］。人們對從各種環(huán)境中分離的擬諾卡氏菌的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，通過發(fā)酵分離出很多結(jié)構(gòu)類型豐富的化合物。Apoptolidins A-G［3-7］、K-252 a-d［8，9］、Lucentamycin A-E［10，11］、Nocapyrones A-G［12，13］、Nocardioazine A-B［14］、Nocazines A-C、Nocazoline A［13］、Nocardiopsin A-B［15］、Naphthospironone A［16］和Griseusins F-G［17］等一系列結(jié)構(gòu)新穎、具有生物活性的天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)為創(chuàng)新藥物研究提供了豐富的來源。

本文通過對35 株擬諾卡放線菌發(fā)酵提取物的TLC 化學(xué)多樣性進(jìn)行篩選，最終將TLC 條帶最為豐富的菌株YIM90087 確定為研究菌株。該菌株是2004 年由李文均等人從中國新疆高鹽土壤中分離出來的一株擬諾卡放線菌，并鑒定為Nocardiopsis gilva sp.nov.［18］。通過對其固體發(fā)酵提取物進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中共分離得到10個化合物，這些化合物的結(jié)構(gòu)類型主要為環(huán)肽類化合物，其中化合物5 為2013 年發(fā)表的一個新的三聯(lián)苯類化合物，化合物4 僅見化學(xué)合成報道，作為天然產(chǎn)物未見報道。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker AM-400 型核磁共振儀;Bruker DRX-500型核磁共振儀;Agilent G3250AA LC/MSD TOF 型質(zhì)譜儀;薄層層析硅膠板和柱層析硅膠G，200～300目(青島海洋化工廠);Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠(Amersham Pharmacia);Waters 高效液相色譜儀(515-2996);島津制備型高效液相色譜儀(LC-8A);其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 發(fā)酵菌株

菌株YIM90087 由云南省微生物研究所唐蜀昆老師提供，該菌種于2004 年由云南省微生物研究所李文均等人鑒定為擬諾卡氏菌屬的一個新種(Nocardiopsis gilva sp.nov.)，菌株保存于云南省微生物研究所。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)基:淀粉20 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母膏2 g/L，KNO32 g/L，MgSO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，1% NaCl。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，CaCl2·2H2O 0.74 g/L，1% NaCl。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，CaCl2·2H2O 0.74 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH=10，5% NaCl。

種子液制備:從新鮮斜面培養(yǎng)中將菌株轉(zhuǎn)接到裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中，于35℃、200 rpm 搖床培養(yǎng)4 d。

將種子液按10%接種量轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基平板中，每個平板裝25 mL 培養(yǎng)基，共發(fā)酵1500個平板，35 ℃培養(yǎng)14 d。

1.4 提取與分離

將發(fā)酵好的固體培養(yǎng)基劃成小塊、粉碎，放于錐形瓶中用等體積丙酮超聲提取3 次，所得提取液經(jīng)減壓濃縮至浸膏，將浸膏懸浮于蒸餾水后加入等體積乙酸乙酯萃取至無色，將乙酸乙酯減壓濃縮，最后得到發(fā)酵粗提物39.9 g。發(fā)酵粗提物經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-甲醇梯度(100∶0、60∶1、40∶1、20∶1、9∶1、1∶1，V/V)洗脫，共得到9個組分(S1～S9)。S2 用石油醚-丙酮(10∶1)柱層析得到化合物5(15 mg)和6(8 mg)。S3 經(jīng)凝膠Sephadex LH-20 柱層析，用甲醇洗脫得化合物1(8 mg)、2(6 mg)和3(5 mg)。S4經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-丙酮(8∶1)洗脫得化合物4(9 mg)、7(7 mg)和8(5 mg)。S7 經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-丙酮(9∶1)洗脫再經(jīng)C18 反相柱層析，用甲醇-水(5 ∶95)洗脫得化合物9(8 mg)，剩余再經(jīng)HPLC 制備，用甲醇-水(10∶90)洗脫得化合物10(9 mg)。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1～10 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compounds 1-10

化合物1 無色針晶(甲醇);mp.267～269 ℃;分子式為C11H12N2O2;ESI-MS m/z:227 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:7.92 (1H，br s，1-NH)，4.06 (1H，m，H-3)，8.19 (1H，br s，4-NH)，3.33-2.72 (2H，d，J=17.4 Hz，H-6)，3.09～2.88 (2H，dd，J=13.4，4.2 Hz，H-7)，7.16 (2H，d，J=5.7 Hz，H-9，13)，7.27 (2H，m，H-10，12)，7.26(1H，m，H-11);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:167.4 (C-2)，55.6 (C-3)，165.9 (C-5)，43.7 (C-6)，38.9 (C-7)，136.0 (C-8)，130.2 (C-9，13)，128.3 (C-10，12)，126.9 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道［19］一致，確定化合物1 為(3S)-3-芐基-2，5-哌嗪二酮。

化合物2 白色粉末;mp.265～266 ℃;分子式為C10H18N2O3;ESI-MS m/z:237 ［M+Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:7.89 (1H，br s，1-NH)，3.57 (1H，m，H-3)，8.08 (1H，br s，4-NH)，3.56(1H，m，H-6)，1.87 (1H，m，H-7)，1.50-1.10 (2H，m，H-8)，0.80 (3H，m，H-9)，0.90 (3H，d，J=6.8 Hz，H-10)，3.97 (1H，m，H-11)，4.86 (1H，br s，11-OH)，1.09 (3H，d，J=6.5 Hz，H-12);13C NMR(DMSO，125 MHz)δ:167.3 (C-2)，58.9 (C-3)，166.9 (C-5)，60.1 (C-6)，38.8(C-7)，24.6(C-8)，11.7(C-9)，15.4(C-10)，66.8(C-11)，20.3(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道［20］基本一致，確定化合物2 為(3S，6S)-3-(2-丁基)-6-(1-羥乙基)-2，5-哌嗪二酮。

化合物3 白色針晶(甲醇);mp.236～238 ℃;分子式為 C9H16N2O3;ESI-MS m/z:223 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:7.93 (1H，br s，1-NH)，3.69 (1H，m，H-3)，8.04 (1H，br s，4-NH)，3.79 (1H，m，H-6)，1.85 (1H，m，H-7)，1.46-1.14 (2H，m，H-8)，0.82 (3H，m，H-9)，0.91 (3H，d，J=6.8 Hz，H-10)，3.65-3.57 (2H，dd，J=10.9，2.8 Hz，H-11);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:166.7(C-2)，58.8 (C-3)，166.2 (C-5)，56.8 (C-6)，38.5(C-7)，24.3 (C-8)，11.8 (C-9)，15.1 (C-10)，62.5(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道［21］基本一致，確定化合物3 為(3S，6S)-3-(2-丁基)-6-羥甲基-2，5-哌嗪二酮。

化合物4 白色針晶(甲醇);mp.90～92 ℃;［α］21D-24.5 (c 9.0，DMF);分子式為C10H9NO3;ESIMS m/z:214 ［M+Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:4.32 (1H，m，H-3)，7.93 (1H，br s，4-NH)，2.92 (2H，s，H-6)，7.17 (2H，d，J=7.2 Hz，H-8，12)，7.26 (2H，m，H-9，11)，7.21 (1H，m，H-10);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:175.4 (C-2)，58.5(C-3)，157.4 (C-5)，36.5 (C-6)，135.7 (C-7)，129.9 (C-8，12)，128.2 (C-9，11)，126.8 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道［22］基本一致，確定化合物4 為(4S)-4-芐基-1，3-惡唑-2，5-二酮。

化合物5 白色針晶(甲醇);分子式為C22H22O5;ESI-MS m/z:389 ［M +Na］+;1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:7.37 (1H，d，J=8.5 Hz，H-2，6)，7.06(1H，d，J=8.5 Hz，H-3，5)，3.88 (3H，s，H-7)，6.76 (1H，s，H-5')，3.69 (3H，s，H-7')，3.61 (3H，s，H-8')，7.55 (2H，d，J=8.6 Hz，H-2''，6'')，6.99(2H，d，J=8.6 Hz，H-3''，5'')，3.87 (3H，s，H-7'');13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:124.4 (C-1)，131.5 (C-2，6)，114.6 (C-3，5)，159.4 (C-4)，55.3(C-7)，121.4 (C-1')，151.4 (C-2')，144.2 (C-3')，135.4 (C-4')，111.4 (C-5')，149.1 (C-6')，60.8(C-7')，，60.7 (C-8')，130.3 (C-1'')，130.2 (C-2''，6'')，113.6 (C-3''，5'')，158.9 (C-4'')，55.3(C-7'')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道［23］一致，確定化合物5 為6'-羥基-4，2'，3'，4''-四甲氧基-對三聯(lián)苯。

化合物6 白色針晶(甲醇);mp.293～295 ℃;分子式為C15H20N2O3;ESI-MS m/z:299 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:9.15 (1H，br s，1-NH)，4.66 (1H，m，H-3)，9.27 (1H，br s，4-NH)，4.18 (1H，m，H-6)，3.57～3.24 (2H，dd，J=13.6，5.3 Hz，H-7)，7.38 (2H，d，J=8.4 Hz，H-9，13)，7.11 (2H，d，J=8.4 Hz，H-10，12)，11.40(1H，br s，11-OH)，1.65-0.97 (2H，m，H-14)，1.96(1H，m，H-15)，0.92 (3H，d，J=6.6 Hz，H-16)，0.90 (3H，d，J=6.6 Hz，H-17);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:169.5 (C-2)，57.7 (C-3)，168.2 (C-5)，54.3 (C-6)，40.4 (C-7)，127.7 (C-8)，132.5(C-9，13)，116.8 (C-10，12)，158.7 (C-11)，45.3(C-14)，24.9 (C-15)，23.7 (C-16)，21.8 (C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道［24］基本一致，確定化合物6 為(3S，6S)-3-(4-羥芐基)-6-異丁基-2，5-哌嗪二酮。

化合物7 白色針晶(甲醇);mp.148～150 ℃;分子式為C10H16N2O2;ESI-MS m/z:219 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:5.76 (1H，br s，2-NH)，3.97 (1H，m，H-3)，3.63 (2H，m，H-6)，2.07-1.92 (2H，m，H-7)，2.41-2.05 (2H，m，H-8)，4.11 (1H，d，J=8.0 Hz，H-9)，2.66 (1H，m，H-10)，1.09 (3H，d，J=7.7 Hz，H-11)，0.95 (3H，d，J=6.8 Hz，H-12);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:169.9 (C-1)，60.5 (C-3)，165.1 (C-4)，45.2 (C-6)，22.4 (C-7)，28.3 (C-8)，58.9 (C-9)，28.5 (C-10)，19.5 (C-11)，16.1 (C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道［25］基本一致，確定化合物7 為(3R，8aS)-3-異丙基-六氫吡咯并［1，2-a］吡嗪-1，4-二酮。

化合物8 白色針晶(甲醇);mp.230～232 ℃;分子式為 C9H16N2O2;ESI-MS m/z:207 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:8.11 (1H，br s，1-NH)，3.76 (1H，m，H-3)，8.14 (1H，br s，4-NH)，3.86 (1H，dd，J=6.7，2.3Hz，H-6)，1.60～1.46 (2H，m，H-7)，1.81 (1H，m，H-8)，0.86 (3H，d，J=6.7 Hz，H-9)，0.88 (3H，d，J=6.7 Hz，H-10)，1.26 (3H，d，J=6.7 Hz，H-11);13C NMR(DMSO，125 MHz)δ:168.4 (C-2)，52.6 (C-3)，168.9 (C-5)，49.9 (C-6)，42.6 (C-7)，23.6 (C-8)，21.9 (C-9)，23.0 (C-10)，19.6 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道［26］一致，確定化合物8 為(3S，6S)-3-異丁基-6-甲基-2，5-哌嗪二酮。

化合物9 白色針晶(甲醇);分子式為C13H16N2O3;ESI-MS m/z:271 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:7.88 (1H，br s，1-NH)，4.08 (1H，m，H-3)，8.20 (1H，br s，4-NH)，3.92 (1H，d，J=3.8 Hz，H-6)，2.93-2.71 (2H，dd，J=7.6，2.6 Hz，H-7)，7.23 (2H，d，J=7.4 Hz，H-9，13)，7.26 (2H，m，H-10，12)，7.21 (1H，m，H-11)，3.35 (1H，m，H-14)，1.08 (3H，d，J=6.5 Hz，H-15);13C NMR(DMSO，125 MHz)δ:167.4 (C-2)，56.6 (C-3)，169.1 (C-5)，60.9 (C-6)，39.3 (C-7)，136.9 (C-8)，130.3 (C-9，13)，128.2 (C-10，12)，126.7 (C-11)，72.6 (C-14)，19.6 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道［27］基本一致，確定化合物9 為(3S，6S)-3-芐基-6-(1-羥乙基)-2，5-哌嗪二酮。

化合物10 白色針晶(甲醇);分子式為C14H18N2O3;ESI-MS m/z:285 ［M +Na］+;1H NMR (DMSO，500 MHz)δ:7.79 (1H，br s，1-NH)，4.06 (1H，m，H-3)，8.13 (1H，br s，4-NH)，3.78 (1H，d，J=3.7 Hz，H-6)，2.90-2.69 (2H，dd，J=7.6，2.5 Hz，H-7)，7.22 (2H，d，J=7.4 Hz，H-9，13)，7.25 (2H，m，H-10，12)，7.19 (1H，m，H-11)，3.93 (1H，m，H-14)，1.55-1.32 (2H，m，H-15)，0.95 (3H，t，J=7.4 Hz，H-16);13C NMR (DMSO，125 MHz)δ:167.6(C-2)，56.9 (C-3)，168.3 (C-5)，59.3 (C-6)，39.5(C-7)，136.8 (C-8)，130.2 (C-9，13)，128.1 (C-10，12)，126.6 (C-11)，73.7 (C-14)，26.1 (C-15)，11.3 (C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道［27］基本一致，從而確定化合物10 為(3S，6S)-3-芐基-6-(1-羥丙基)-2，5-哌嗪二酮。

3 討論

本研究從35 株擬諾卡放線菌中通過對菌株發(fā)酵提取物的TLC 化學(xué)多樣性進(jìn)行篩選，最終確定了YIM90087 為研究菌株，在對目標(biāo)菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)擬諾卡放線菌對培養(yǎng)基要求較高，且擬諾卡放線菌生長緩慢，由于我們對培養(yǎng)基的優(yōu)化不夠全面，導(dǎo)致了發(fā)酵產(chǎn)物總量較少，這樣某些含量較低、成分復(fù)雜的代謝產(chǎn)物，不能得到有效的分離和結(jié)構(gòu)鑒定，今后還需對其培養(yǎng)基進(jìn)行更為全面的優(yōu)化，并對其中的微量成分進(jìn)一步深入研究。

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