馮 磊，譚 瑩，陳 爽，邱麗穎*，金 堅

1江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院;2 江南大學(xué)藥學(xué)院，無錫 214122

合歡屬Albizzia 為豆科含羞草亞科植物［1］，是Albizzia julibrissin Durazz 的樹皮［2］，具有解郁安神、活血消腫之功效。已有文獻(xiàn)報道合歡皮乙醇粗提物在體內(nèi)明顯抑制血管生成，阻止腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和遷移，同時存在一定的毒性作用［3-9］。本文通過制備合歡皮總皂苷，考察其對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)增殖的抑制作用，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞周期分布改變，初步探討其抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株

實驗所用細(xì)胞株為SV40 猿猴空泡病毒轉(zhuǎn)染人臍靜脈微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1(Human Microvascular Endothelial Cells)，由法國國家衛(wèi)生醫(yī)藥研究院U553 研究所提供。

1.2 藥物與試劑

合歡皮為豆科植物合歡Albizzia julibrissin Durazz 的干燥樹皮，購自無錫山禾集團(tuán)健康參藥連鎖有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定，符合《中華人民共和國藥典》2010 版標(biāo)準(zhǔn)［10］;細(xì)胞全基因DNA 抽提試劑盒，購自北京天根生物技術(shù)有限公司;SRB、PI 均購自美國Sigma 公司。

1.3 主要儀器

SY18-WJ2/3 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技公司);SW-CJ-IF 超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司);Multiskan MK3 自動酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技公司);BX40 顯微鏡(Olympus 公司);FAC SCIalibur 流式細(xì)胞儀(美國BD 公司)。

2 實驗方法

2.1 合歡皮總皂苷樣品的制備

稱取合歡皮，加入60 倍70%乙醇，加熱回流提取2 次，每次2.5 h，過濾，合并濾液，得提取液;提取液減壓回收乙醇并冷凍干燥;取合歡皮提取物凍干粉經(jīng)D101 大孔樹脂分離，依次用蒸餾水及30%、70%乙醇沖洗。收集70%乙醇洗脫餾分，減壓回收乙醇，冷凍干燥得合歡皮總皂苷粉末，并分析其干物質(zhì)量及總皂苷含量。

2.2 人微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的觀察及增殖的測定

按常規(guī)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱以10%的小牛血清傳代培養(yǎng)HMEC-1 細(xì)胞，試驗時將細(xì)胞以8 ×103個/孔接種于96 孔板，生長至對數(shù)期后同步化培養(yǎng)24 h。取合歡皮總皂苷凍干粉，以全培養(yǎng)基分別配制至終濃度為1.0、1.5、2.0 μg/mL 作為加樣組，分別作用細(xì)胞48、72 h，采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。藥物作用結(jié)束后，選用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法，去上清，每孔加入100 g/L 三氯醋酸100 μL 固定，靜置5 min 后移到4℃再放置至40 min，傾掉固定液，用去離子水洗5遍，空氣干燥，每孔加入4 g/L SRB 100 μL 室溫放置30 min，用10 ml/L 醋酸液洗5 遍，加入150 μL 10 mmol/L Tris 堿液(pH 10.5)溶解，在540 nm 波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值OD。以陰性組(不加合歡皮總皂苷干預(yù)，顯色為正常細(xì)胞與試劑反應(yīng))和空白組(不加任何物質(zhì)，顯色為試劑反應(yīng))為對照，按以下公式計算合歡皮總皂苷對HMEC-1 細(xì)胞生長的抑制率。

2.3 臺盼藍(lán)染色觀察人微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜通透性

取對數(shù)期細(xì)胞經(jīng)同步化培養(yǎng)24 h，按“2.2”項所述步驟加入不同濃度的合歡皮總皂苷，繼續(xù)在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 或72 h，消化收集細(xì)胞(包括漂浮細(xì)胞)，1000 rpm 離心5 min，棄去培養(yǎng)基，PBS 重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至5 ×104個/mL。加入0.2%臺盼藍(lán)溶液，滴在載玻片上，以陰性組(不加合歡皮總皂苷干預(yù))為對照進(jìn)行觀察。

2.4 DNA Ladder 觀察人微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

采用DNA 梯形條帶(DNA Ladder)法，對數(shù)期細(xì)胞經(jīng)同步化培養(yǎng)24 h，按“2.3”項所述步驟收集不同濃度的合歡皮總皂苷作用后的細(xì)胞，按細(xì)胞全基因組DNA 提取試劑盒步驟說明，提取細(xì)胞全基因組的DNA，4 ℃冰箱備用。制備1.8%瓊脂糖凝膠，60 V 電泳1 h，用紫外投射儀觀察梯形條帶，并攝影，以陰性組(不加合歡皮總皂苷干預(yù))為對照進(jìn)行觀察。

2.5 流式細(xì)胞儀分析人微血管內(nèi)皮細(xì)胞周期

取對數(shù)期細(xì)胞經(jīng)同步化培養(yǎng)24 h，按“2.3”項所述步驟收集不同濃度的合歡皮總皂苷作用后的細(xì)胞，1000 rpm 離心5 min，棄去培養(yǎng)基，PBS 漂洗2次，在終濃度為70%的乙醇溶液中，冰上固定2 h，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。上機(jī)前離心除去固定液，PBS 漂洗，滴加新鮮配制的PI 染液，調(diào)至細(xì)胞濃度為1 ×104個/mL，4 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

3 實驗結(jié)果

3.1 合歡皮總皂苷對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

所制合歡皮總皂苷粉末的干物質(zhì)提取率為2.95%，總皂苷含量為63.18%。由圖1 可見，HMEC-1 細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，其中作用48 h 時，合歡皮總皂苷對HMEC-1 細(xì)胞的抑制效果較好，其IC50為1.5 μg/mL。

圖1 合歡皮總皂苷對HMEC-1 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell proliferation

3.2 合歡皮總皂苷對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響

通過光學(xué)顯微鏡可以發(fā)現(xiàn)，陰性組中細(xì)胞生長良好，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，加入合歡皮總皂苷干預(yù)后，隨著劑量的增加，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與陰性組形成顯著的差異，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 合歡皮總皂苷對HMEC-1 細(xì)胞形態(tài)的影響(100 ×)Fig.2 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell morphology (100 ×)

3.3 合歡皮總皂苷對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜通透性的影響

圖3 合歡皮總皂苷對HMEC-1 細(xì)胞膜完整性的影響(臺盼藍(lán)染色，200 ×)Fig.3 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell membrane integrity (Trypan blue staining，200 ×)

臺盼藍(lán)染色表明，隨著合歡皮總皂苷劑量的增加，特別是高劑量組(2.0 μg/mL)有些細(xì)胞開始出現(xiàn)被染成藍(lán)色的現(xiàn)象，正常細(xì)胞和凋亡早期細(xì)胞排斥臺盼藍(lán)染料，凋亡晚期和壞死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性變化，出現(xiàn)攝取染料變藍(lán)的現(xiàn)象，說明合歡皮總皂苷在高劑量下有可能改變細(xì)胞膜的通透性，引起細(xì)胞的凋亡壞死，結(jié)果如圖3 所示。

3.4 DNA Ladder 分析觀察人微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的情況

電泳凝膠成像如圖4 顯示，合歡皮總皂苷作用48 h 后三個劑量組均出現(xiàn)凋亡梯形條帶現(xiàn)象，而在高劑量組(2.0 μg/mL)甚至出現(xiàn)了彌散現(xiàn)象，初步推斷高劑量的合歡皮總皂苷可能使細(xì)胞發(fā)生了壞死現(xiàn)象。

圖4 合歡皮總皂苷對HMEC-1 細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 The intervention effect of A.julibrissin saponins on HMEC-1 cell apoptosis

3.5 合歡皮總皂苷對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞周期的影響

由表1 所示，合歡皮總皂苷各劑量組干預(yù)48 h和72 h 后，細(xì)胞被阻滯在亞G0/G1期，G0/G1期所占比例減少，且細(xì)胞周期變化呈藥物劑量和時間的依賴關(guān)系。

4 討論

內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移、基質(zhì)降解及血管重構(gòu)、血管和血管網(wǎng)形成等，在腫瘤新生血管生成過程中起著極重要的作用，其中最重要的是內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。已有文獻(xiàn)報道合歡皮粗提取物在動物體內(nèi)明顯抑制腫瘤新生血管生成，從而抑制腫瘤生長、侵襲和遷移［3-9］。

本文證明合歡皮總皂苷可顯著抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1 的體外增殖，且與時間、劑量均存在依賴關(guān)系，作用48 h 后的IC50為1.5 μg/mL。高劑量組(2.0 μg/mL)作用時，光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量減少，臺盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)其可能改變細(xì)胞膜的通透性，DNA 梯形條帶法發(fā)現(xiàn)其引起HMEC-1 細(xì)胞DNA彌散，提示出現(xiàn)細(xì)胞壞死現(xiàn)象。流式細(xì)胞儀PI 單染結(jié)果顯示，合歡皮總皂苷可使HMEC-1 細(xì)胞周期阻滯在亞G0/G1期。

表1 合歡皮總皂苷作用后HMEC-1 細(xì)胞周期分布Table 1 HMEC-1 cell cycle under A.julibrissin saponins intervention

綜上所述，合歡皮總皂苷提取物具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，使細(xì)胞周期阻滯在亞G0/G1期，在高劑量作用下可能引起細(xì)胞產(chǎn)生壞死。

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