羅李娜， 向德標(biāo)， 胡喬銘， 裴 剛

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室，湖南 長沙410208)

野鴉椿Euscaphis japonica 為省沽油科Staphyleaceae 野鴉椿屬Euscaphis 落葉灌木，野鴉椿籽為其干燥果實(shí)［1］。野鴉椿籽有溫中理氣，消腫止痛，祛風(fēng)除濕之效［2］。據(jù)《湖南藥物志》載:野鴉椿籽治寒疝腫痛、睪丸腫、脫肛、子宮脫垂。《四川中藥志》載:野鴉椿籽性微溫，味苦，無毒，可治月瘕、月經(jīng)不調(diào)、膀胱疝氣、痢疾泄瀉?！陡＝ㄋ幬镏尽份d: “果治頭痛，眩暈，感冒，蕁麻疹，漆過敏，疝氣;根治風(fēng)濕，腰痛，胃痛，產(chǎn)后風(fēng)。在福建南平地區(qū)，民間常用野鴉椿籽水煎液用于產(chǎn)婦產(chǎn)褥感染所致的發(fā)燒及炎癥的治療。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球每年至少導(dǎo)致75 000 名產(chǎn)婦死亡，發(fā)展中國家由于衛(wèi)生條件和治療技術(shù)較落后，成為了產(chǎn)褥熱的高發(fā)區(qū)［3］，產(chǎn)褥感染主要致病菌為甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌、肺炎雙球菌等［4-5］。早在19 世紀(jì)晚期，Louis Pasteur 發(fā)現(xiàn)并提出產(chǎn)褥感染主要是由鏈球菌引起的［6］。趙宏偉等［7］研究表明，乙型溶血性鏈球菌是鏈球菌中致病性最強(qiáng)的一種，可引起各種化膿性炎癥、產(chǎn)褥熱。為此，本實(shí)驗(yàn)研究野鴉椿籽不同極性部位提取物對臨床分離的菌株和常見致病菌的抑制作用，通過體外活性篩選抑菌實(shí)驗(yàn)，從抑菌活性的角度出發(fā)，為尋找天然藥物中抑菌的成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材 野鴉椿籽，采于福建省南平，經(jīng)鑒定為省沽油科植物野鴉椿Euscaphis japonica 的干燥果實(shí)。

1.2 供試菌種 金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，甲型溶血性鏈球菌，乙型溶血性鏈球菌，肺炎鏈球菌，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)微生物與免疫學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心惠贈。

1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂(杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)，批號20110823-02);營養(yǎng)肉湯(杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)，批號20110926-05);血瓊脂平板(鄭州安圖綠科生物工程有限公司，批號20121211);小牛血清(杭州四季青公司，批號9610003)。

1.4 儀器設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-75KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 (GNP-9160BS-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 耐藥菌株的篩選 采用瓊脂平板法［8］，參照武雪芬［9］的方法判斷結(jié)果。

2.2 不同極性提取物的制備 分別稱取2 份干燥粉碎野鴉椿籽，每份400 g。一份置于圓底燒瓶中，加水回流提取3次，每次加水1 000 mL 回流提取2 h，合并提取液，濃縮至小體積，加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置24 h，過濾沉淀，母液濃縮干燥，分別得到水提醇沉物51.3 g，水提醇沉液濃縮物23.8 g;另一份野鴉椿籽置于圓底燒瓶中，加70%乙醇回流提取3 次，每次加乙醇1 000 mL，回流提取2 h，合并提取液，回收乙醇，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，分別得二氯甲烷萃取物15.3 g，乙酸乙酯萃取物32.2 g，正丁醇萃取物18.5 g，水溶物9.3 g。臨用前將不同極性部位低溫冷凍干燥成粉末，分別取2.4 g，溶于30 mL 適當(dāng)溶劑配制成80 mg/mL 的溶液。

2.3 培養(yǎng)基的制備 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌(120 ℃，15 Pa)30 min 后，冷卻至60 ℃時倒入培養(yǎng)皿中，制備平板培養(yǎng)基，備用;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌(120 ℃，15 Pa)30 min 后，冷卻，備用。

2.4 菌懸液的制備 將所有供試菌株分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 活化，待用。挑取瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落，用滅菌生理鹽水校正菌液濃度，再用營養(yǎng)肉湯稀釋至含菌量約107CFU/mL。稀釋后的菌液在15 min 內(nèi)接種，備用。

2.5 MIC 的測定［10］取滅菌小試管11 支為一組，其中每組第11 支為陰性對照。每支試管分別加入營養(yǎng)肉湯2 mL。配制野鴉椿籽不同極性提取物原液質(zhì)量濃度為80 mg/mL。用吸管吸取藥液1 mL 放入第1 管內(nèi)，混勻后吸取1 mL 放入第2 管，同樣混勻后吸出1 mL 放入第3 管。依此二倍稀釋法［11］逐管進(jìn)行稀釋至第10 管。各管藥質(zhì)量物濃度分別為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 1 mg/mL，未達(dá)到抑菌質(zhì)量濃度按原液質(zhì)量濃度一倍增加或者一倍稀釋。各管均加入菌液0.1 mL，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出，觀察生長情況。在對照管符合要求的情況下，以肉眼未見生長的最低藥物質(zhì)量濃度為野鴉椿籽對細(xì)菌的MIC。再從未見細(xì)菌生長的試管中取0.02 mL 于相應(yīng)培養(yǎng)基的瓊脂平板上作次代培養(yǎng)，培養(yǎng)過夜，觀察有無細(xì)菌生長。試驗(yàn)結(jié)果列于表1、表2。

由表1 可知，醇提取液抑菌效果較水提取液抑菌效果明顯，與同一批次乙醇提取液萃取得到的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取液以及萃取后水層液，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌五種致病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果列于表2。

表1 水提物與醇提物MIC (mg/mL)*

表2 不同極性萃取液MIC (mg/mL)

結(jié)果顯示，野鴉椿籽提取物對各實(shí)驗(yàn)菌株均有不同程度的抑制作用，對甲型溶血性鏈球菌的抑制作用最強(qiáng)，二氯甲烷部分、正丁醇部分對各實(shí)驗(yàn)菌株的抑制作用最強(qiáng)，與乙醇提取液相比，二氯甲烷部分對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌抑制效果較好，正丁醇部分對乙型溶血性鏈球菌也較好，萃取后水層部分MIC 值均為10.00 mg/mL。

3 小結(jié)與討論

目前，溶血性鏈球菌為產(chǎn)褥熱最常見的致病菌，同時又表現(xiàn)為多重耐藥性，給臨床治療帶來了極大的困難。隨著抗生素的濫用，給人們帶來的危害越來越明顯了，細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性和抗藥性，以致普通的抗生素對一些炎癥起不到應(yīng)有的療效。近年來，鏈球菌感染致產(chǎn)褥熱成為了主流的研究方向，Green［12］對上世紀(jì)80 年代歐洲導(dǎo)致產(chǎn)褥熱死亡的致病菌進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)致病菌為革蘭陽性甲型鏈球菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示野鴉椿籽中的有效成分對由甲型溶血性鏈球菌為主引起的炎癥能起到很好的療效。野鴨椿過去作為觀賞性植物研究較多，但是關(guān)于藥用成分及作用機(jī)理研究未引起人們的重視［13-14］。2004 年來，有關(guān)野鴉椿的研究文獻(xiàn)逐年增多，多集中于其抗炎、抗纖維化、抗細(xì)胞增殖等方面的報道。臨床上其用于殺蟲和殺菌，為研究野鴉椿的藥理指明了方向。目前，野鴉椿的殺蟲殺菌、抗炎、抗肝纖維及抗癌成分的篩選及研究正處于發(fā)展中，發(fā)展前景廣闊［15］。2012 年8 月1 日，國家出臺的《抗菌藥物臨床應(yīng)用管理辦法》正式實(shí)施，該辦法的實(shí)施使抗生素的臨床應(yīng)用受到限制，同時也為治療感染的中成藥新藥研發(fā)提供了更大的發(fā)展機(jī)會。

在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)野鴉椿籽總提取物具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用，因此擬定對其抗菌活性部位進(jìn)一步追蹤。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野鴉椿籽不同溶劑提取物對5 種供試細(xì)菌的抑制作用均較為明顯，為野鴉椿籽抑菌活性部位，所選細(xì)菌也具有一定的代表性。乙醇提取液對5 種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌的抑制活性均較高;二氯甲烷萃取液、正丁醇萃取液對5 種菌的MIC 也較高，對金黃色葡萄球菌效果最好的是二氯甲烷萃取液，大腸桿菌和甲型溶血性鏈球菌尤以乙醇提取液抑菌效果最好，正丁醇萃取液對乙型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌抑菌效果最好。抑菌活性部位和活性成分的確定為進(jìn)一步闡明野鴉椿籽有效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野鴉椿籽提取物對5 種菌均有很強(qiáng)的抗菌活性，尤其是二氯甲烷、正丁醇部位。目前，正針對這兩部分進(jìn)行進(jìn)一步研究其化學(xué)成分和活性，從而發(fā)現(xiàn)新的活性單體，篩選出抗菌活性更強(qiáng)的天然抑菌劑。

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