靳雙星，張桂枝

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院畜牧工程系，鄭州 450046）

復(fù)方中藥合劑對AA肉仔雞脾臟和法氏囊結(jié)構(gòu)及發(fā)育的影響

靳雙星，張桂枝

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院畜牧工程系，鄭州 450046）

選用7日齡健康A(chǔ)A肉仔雞240只，隨機(jī)分4組，每組設(shè)5個重復(fù)，對照組自由飲水，試驗(yàn)組按0.5%、1%、1.5%的濃度添加復(fù)方中藥合劑于飲水中，試驗(yàn)期為4周。分別于14日齡、21日齡、28日齡和35日齡，每組隨機(jī)抽取10只雞，頸靜脈放血致死，取法氏囊和脾臟，測定脾臟和法氏囊指數(shù)。在免疫器官指數(shù)對比的基礎(chǔ)上，選取效果最佳組和對照組的脾臟和法氏囊，固定，制作石蠟切片，H·E染色，顯微觀察、拍照。與對照組相比，試驗(yàn)組顯著或極顯著提高肉仔雞21、28及35日齡的脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)（P＜0.05或P＜0.01）。1%濃度添加組脾小體平均直徑、動脈周圍淋巴鞘平均面積和法氏囊淋巴濾泡平均面積顯著或極顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01）；并且脾臟結(jié)構(gòu)清晰，白髓內(nèi)的脾小體數(shù)量較多；脾動脈周圍淋巴鞘明顯增厚，鞘內(nèi)淋巴細(xì)胞密集；法氏囊內(nèi)淋巴小結(jié)數(shù)量較多，排列緊密，法氏囊皺襞發(fā)達(dá)，皺襞內(nèi)淋巴細(xì)胞增多。說明復(fù)方中藥合劑能顯著促進(jìn)AA肉仔雞脾臟和法氏囊的發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

復(fù)方中藥合劑；免疫器官指數(shù)；脾臟；法氏囊

近年來，畜禽免疫抑制危害嚴(yán)重，畜禽免疫功能下降，造成免疫失敗、混合感染增加、生產(chǎn)性能下降、死亡率上升，給養(yǎng)殖者造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，如何增強(qiáng)畜禽免疫功能引起關(guān)注。中草藥及其制劑因其具有安全、高效、低毒、低殘留、價(jià)格低廉、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在動物疫病防控中發(fā)揮重要作用[1-2]。研究表明，許多中草藥具有免疫增強(qiáng)作用，能提高機(jī)體的非特異性和特異性免疫功能[2-8]。但多數(shù)采用單味中草藥提取物進(jìn)行研究，然而中藥方劑講究配伍，配伍不同，藥效和功能變化很大。本研究科學(xué)組方，研制出以連翹、板藍(lán)根、黃芪等中藥組成的復(fù)方中藥合劑。通過在飲水中添加不同劑量的復(fù)方中藥合劑，測定肉仔雞的脾臟、法氏囊指數(shù)并觀察其組織結(jié)構(gòu)變化，探討復(fù)方中藥合劑對肉仔雞免疫功能影響，旨在為獸醫(yī)臨床及生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

復(fù)方中藥合劑由連翹、板藍(lán)根、黃芪、甘草、茯苓、白術(shù)、枳實(shí)、山楂等中藥組成。連翹采用醇提法提取連翹提取物；白術(shù)、枳實(shí)采用蒸餾法提取揮發(fā)油，濾液與黃芪、茯苓、甘草、山楂、板藍(lán)根混合水煎2次，合并上述濾液濃縮至相對密度1.10（溫度60℃）、加入乙醇使其沉淀，濾過；濾液與連翹提取物混合，加入白術(shù)、枳實(shí)揮發(fā)油及吐溫-80，加入30%蔗糖，調(diào)節(jié)藥物濃度至1∶1，并調(diào)節(jié)pH 7.0，流通蒸汽滅菌，備用。

1.2 主要儀器和試劑

水浴鍋（常州澳華儀器有限公司，型號：HH-4）；石蠟切片機(jī)（德國Leica，型號：2016）；測微尺、顯微鏡、OlympusCH-30顯微攝影系統(tǒng)（日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社，型號：CH-30）；甲醛溶液、各級濃度的酒精、二甲苯、鹽酸酒精、冰醋酸、石蠟、中性樹膠、蘇木素染色液、伊紅染色液等。

1.3 試驗(yàn)動物與分組

1日齡健康A(chǔ)A雄性肉仔雞，隔離飼養(yǎng)至7日齡，選取240只體重相近健康肉仔雞，隨機(jī)分為4組，即為試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組和對照組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)12只雞，分籠飼養(yǎng)。試驗(yàn)組從7日齡開始，飲水中分別添加體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%的的復(fù)方中藥合劑，對照組正常飲水，試驗(yàn)期4周。采用兩階段三層籠養(yǎng)，24 h光照、自由采食、自由飲水。整個飼養(yǎng)期分為2個階段，1～21 d為前期；22～35 d為后期。基礎(chǔ)日糧參照NRC（1994）肉仔雞營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制。所有雞均在7日齡1倍量點(diǎn)眼滴鼻接種新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗；14日齡1.5倍量滴口接種法氏囊病中等毒力偏弱疫苗；21日齡3倍量飲水接種新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗；28日齡3倍量飲水接種法氏囊病中等毒力偏強(qiáng)疫苗。

1.4 檢測指標(biāo)及測定方法

1.4.1 免疫器官指數(shù)測定

于14、21、28和35日齡，每重復(fù)隨機(jī)抽取2只體重相近健康的肉仔雞，每個處理組共選10只雞，分別稱重，頸靜脈放血致死，迅速摘取脾臟和法氏囊，進(jìn)行稱重并計(jì)算其免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)=免疫器官重量（g）/試驗(yàn)階段體重（kg）。

1.4.2 組織切片制作

在35日齡測定免疫器官指數(shù)后，迅速把脾臟和法氏囊置于固定液中，結(jié)合免疫器官指數(shù)4次測定結(jié)果，選取對免疫器官指數(shù)影響顯著的試驗(yàn)組與對照組脾臟和法氏囊，制作石蠟組織切片，參照文獻(xiàn)[9]，顯微攝影系統(tǒng)觀察、測量與攝影。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0中One-Way ANOVA過程進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05或P＜0.01作為差異顯著或極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中藥合劑對肉仔雞脾臟指數(shù)的影響

由表1可知，14日齡，試驗(yàn)2、3組脾臟指數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05）。21日齡，試驗(yàn)2、3組脾臟指數(shù)極顯著高于對照組（P＜0.01）。28日齡，試驗(yàn)2、3組脾臟指數(shù)顯著高于試驗(yàn)1組（P＜0.05），極顯著高于對照組（P＜0.01）。35日齡，試驗(yàn)2、3組脾臟指數(shù)顯著高于試驗(yàn)1組（P＜0.05），極顯著高于對照組（P＜0.01）。

2.2 復(fù)方中藥合劑對肉仔雞法氏囊指數(shù)的影響

由表2可知，14日齡，試驗(yàn)組法氏囊指數(shù)均高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。21日齡，試驗(yàn)2、3組法氏囊指數(shù)顯著高于試驗(yàn)1組和對照組（P＜0.05）。28日齡，試驗(yàn)2、3組法氏囊指數(shù)顯著高于試驗(yàn)1組（P＜0.05），極顯著高于對照組（P＜0.01）。35日齡，試驗(yàn)2、3組法氏囊指數(shù)顯著高于試驗(yàn)1組（P＜0.05），極顯著高于對照組（P＜0.01）。

2.3 復(fù)方中藥合劑對肉仔雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 對肉仔雞脾小體平均直徑和動脈周圍淋巴鞘平均面積的影響

由表3可知，試驗(yàn)2組脾小體平均直徑顯著高于對照組（P＜0.05）；試驗(yàn)2組動脈周圍淋巴鞘平均面積極顯著高于對照組（P＜0.01）。

表1 飲水中添加復(fù)方中藥合劑對肉仔雞脾臟指數(shù)的影響Table 1 Effects of Compound traditional Chinese medicine mixtures on organ indexes of Spleens in Broilers（g·kg-1）

表2 飲水中添加復(fù)方中藥合劑對肉仔雞法氏囊指數(shù)的影響Table 2 Effects of Compound traditional Chinese medicine mixtures on organ indexes of Fabricius in Broilers（g·kg-1）

表3 復(fù)方中藥合劑對肉仔雞脾小體平均直徑和動脈周圍淋巴鞘平均面積的影響Table 3 Effects of Compound traditional Chinese medicine mixtures on diameters of spleen node and area of periaterial lymphatic sheath in Broilers

2.3.2 對脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

從圖1、2可知，與對照組相比，試驗(yàn)2組肉雞脾臟的結(jié)構(gòu)清晰，脾動脈周圍淋巴鞘明顯增厚，鞘內(nèi)淋巴細(xì)胞密集；白髓內(nèi)的脾小體數(shù)量較多，體積增大，淋巴細(xì)胞數(shù)量增多。

圖1 對照組脾臟（200×，H.E）Fig.1 Spleens of control group

圖2 試驗(yàn)2組脾臟（200×，H.E）Fig.2 Spleens of experimental 2 group

2.4 復(fù)方中藥合劑對肉雞法氏囊組織結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 對肉仔雞法氏囊淋巴濾泡面積的影響

由表4可知，試驗(yàn)2組法氏囊淋巴濾泡面積極顯著高于對照組（P＜0.01）。

表4 復(fù)方中藥合劑對肉仔雞法氏囊淋巴濾泡面積的影響Table 4 Effects of Compound traditional Chinese medicine mixtures on area of lymphoid follicle of fabricius in Broilers（μm2）

2.4.2 對法氏囊組織結(jié)構(gòu)的影響

從圖3、4可知，與對照組相比，試驗(yàn)2組法氏囊內(nèi)淋巴小結(jié)數(shù)量較多，排列緊密，大小均勻，體積較大，法氏囊皺襞發(fā)達(dá)，皺襞內(nèi)淋巴細(xì)胞增多，而對照組法氏囊皺襞較小，法氏囊淋巴小結(jié)大小不均，淋巴細(xì)胞較少，法氏囊有退化現(xiàn)象。

圖3 對照組法氏囊（100×H.E）Fig.3 Fabricius of control group

圖4 試驗(yàn)2組法氏囊（100×H.E）Fig.4 Fabricius of experimental 2 group

3 討論與結(jié)論

3.1 組方原理及藥理作用分析

本復(fù)方中藥合劑是由連翹、板藍(lán)根、黃芪、甘草、茯苓、白術(shù)、枳實(shí)、山楂等中藥組成。其中，黃芪、白術(shù)是君藥，茯苓、板藍(lán)根、連翹是臣藥，枳實(shí)，山楂是佐藥，甘草是使藥。黃芪、白術(shù)補(bǔ)中益氣，茯苓健脾利水，板藍(lán)根、連翹扶正祛邪，枳實(shí)破積行氣，山楂消食健脾，甘草調(diào)和諸藥，因此此方具有補(bǔ)中益氣，健脾和胃，兼以清熱解毒、消導(dǎo)理氣的作用。現(xiàn)代藥理研究表明，方中黃芪、板藍(lán)根、茯苓、白術(shù)、甘草及連翹等都具有免疫增強(qiáng)作用，能顯著促進(jìn)雞脾臟和法氏囊的發(fā)育和免疫活性細(xì)胞的生成，并可增加血液中白細(xì)胞總數(shù)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬功能，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫[7-8,10-14]。

3.2 復(fù)方中藥合劑對肉仔雞脾臟和法氏囊指數(shù)的影響

脾臟和法氏囊是禽類重要免疫器官，是免疫細(xì)胞發(fā)生、分化、成熟、定居、增殖及產(chǎn)生免疫應(yīng)答場所[15-16]。機(jī)體免疫力的強(qiáng)弱取決于免疫器官狀況，衡量免疫器官狀況的重要指標(biāo)是免疫器官指數(shù)。通過測定免疫器官指數(shù)，可從生長發(fā)育角度評價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)和免疫能力[17]。試驗(yàn)結(jié)果表明，飲水中添加一定劑量的復(fù)方中藥合劑可顯著提高肉仔雞脾臟和法氏囊指數(shù)，這與謝紅兵[3]、葛劍[4]和唐勝球[6]等報(bào)道的結(jié)果基本一致。說明本中藥復(fù)方合劑可促進(jìn)肉仔雞淋巴器官的生長發(fā)育和迅速成熟，這與方劑中含復(fù)合多糖成分促進(jìn)免疫器官的發(fā)育有關(guān)[7-8,10-12]。比較研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著中藥合劑用量增加，促進(jìn)免疫器官指數(shù)增加，但以1.0%用量的效果最佳。1.5%試驗(yàn)組沒有1%試驗(yàn)組效果好，是否因濃度太高影響適口性或長期采食酸性物質(zhì)積累而導(dǎo)致采食量下降影響免疫增強(qiáng)效果，有待于進(jìn)一步研究。

3.3 復(fù)方中藥合劑對肉仔雞脾臟和法氏囊組織結(jié)構(gòu)的影響

脾臟良好發(fā)育對提高肉雞的免疫功能起重要作用[18]。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組脾小體平均直徑顯著高與對照組，動脈周圍淋巴鞘平均面積極顯著高于對照組；脾臟的結(jié)構(gòu)清晰，脾動脈周圍淋巴鞘明顯增厚,鞘內(nèi)淋巴細(xì)胞密集；白髓內(nèi)的脾小體數(shù)量較多，體積增大，淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，說明復(fù)方中藥合劑能顯著地促進(jìn)脾臟發(fā)育，提高脾臟的免疫功能，這與史秋梅研究結(jié)果基本一致[19]。法氏囊的囊壁形成一些皺襞，皺襞內(nèi)分布著很多腔上囊淋巴濾泡，淋巴濾泡內(nèi)含有豐富的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，隨著淋巴濾泡面積的增加，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量也在增加，因此，法氏囊淋巴濾泡面積是反應(yīng)法氏囊功能的重要指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組法氏囊淋巴濾泡面積極顯著高于對照組；且法氏囊內(nèi)淋巴小結(jié)數(shù)量較多，排列緊密，大小均勻，體積較大，法氏囊皺襞發(fā)達(dá)，皺襞內(nèi)淋巴細(xì)胞增多，說明復(fù)方中藥合劑可延緩肉仔雞法氏囊的退化，促進(jìn)法氏囊的發(fā)育，提高法氏囊的免疫功能。這與金光明等的試驗(yàn)結(jié)果基本一致[20]。復(fù)方中藥合劑可增加免疫器官重量和免疫器官指數(shù)，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，改善脾臟和法氏囊組織結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)免疫器官的免疫功能。添加1.0%的劑量效果最佳。

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Effect of compound traditional chinese medicine mixtures on tissue structure and development of spleen and fabricius in broilers

JIN Shuangxing,ZHANG Guizhi
(Animal Department,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China)

240 healthy AA broilers at the age of 7 day old were selected,and divided into experimental and control groups randomly.There were 5 repeating groups in each group.The control group was watered normally,and the experimental groups were watered with 0.5%,1.0%and 1.5%the compound traditional Chinese medicine mixtures,respectively.The trial period was 4 weeks.On 14,21,28 and 35 days old after gavaged,10 chickens were sampled randomly from each group and slaughtered by bloodletting in jugular vein.Then Fabricius and spleens were collected for determination of immune organs index.Spleens and Fabricius were randomly selected from the best experimental groups and control group and fixed.Paraffin sections were stained with HE and observed under microscope.The results showed that the immune organ indexes were significantly higher in the experimental groups than those of in the control group in aged 21,28and 35 days(P＜0.05 orP＜0.01).The diameters of spleen node and area of periaterial lymphatic sheath and lymphoid follicle of fabricius of the experimental 1%groups were significantly higher than the control group（P＜0.05 orP＜0.01).The structure of spleen was clear.The amount of splenic nodule increased in white pul.Splenic periarterial lymphatic sheath thickening,lymphocyte becomes more and more intensive.The amount of lymphoid nodule in bursa of fabricius increased and arranged closely.Folds of fabricius had more developed and increased in lymphocyte numbers.These results showed that the compound traditional Chinese medicine mixtures could improve and enhance the immune function in broilers.

compound traditional Chinese medicine mixture;immune organ indexe;spleen;fabricius

S831.7

A

1005-9369（2014）04-0094-05

2013-10-15

河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2011A230013）

靳雙星（1970-），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)樾笄菀卟》乐?。E-mail:jinshuangxing@126.com

時間2014-4-21 13:22:46[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1323.014.html

靳雙星,張桂枝.復(fù)方中藥合劑對AA肉仔雞脾臟和法氏囊結(jié)構(gòu)及發(fā)育的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(4)∶94-98.

Jin Shuangxing,Zhang Guizhi.Effect of compound traditional chinese medicine mixtures on tissue structure and development of spleen and fabricius in broilers[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶94-98.(in Chinese with English abstract)