劉海龍，黎妍妍,，嚴(yán)亞琴，鄭 露，李錫宏，黃俊斌*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，湖北省作物病害監(jiān)測(cè)和安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030）

煙草青枯病是煙草上發(fā)生最重要的土傳病害之一，由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起，其寄主范圍包括54個(gè)科的450余種植物[1]。1864年在印尼首先報(bào)道了青枯菌對(duì)煙草的毀滅性危害。此后，該病逐漸成為美國(guó)、日本、澳大利亞、韓國(guó)等許多產(chǎn)煙國(guó)家煙草重要的細(xì)菌病害[2-3]。煙草青枯病在我國(guó)主要產(chǎn)煙區(qū)普遍發(fā)生，其中以廣東、廣西、福建、湖南及貴州煙區(qū)危害最為嚴(yán)重[4]。近年來(lái)，由于氣候變化等原因，該病的發(fā)生范圍在我國(guó)有由南向北蔓延之勢(shì)[5]。

培育和推廣抗病品種是防治煙草青枯病最有效的措施，但由于不同地理起源或寄主來(lái)源的青枯菌具有明顯的生理分化現(xiàn)象[6]，極易導(dǎo)致篩選的抗病品種喪失抗病性。因此，進(jìn)行煙草青枯菌的生理分化研究對(duì)選育和推廣抗病品種具有重要作用。

目前，國(guó)際上公認(rèn)的青枯菌亞分類系統(tǒng)有：一是根據(jù)青枯菌侵染的寄主范圍和對(duì)3種雙糖和3種己醇的利用能力分別將其劃分為5個(gè)生理小種（r1，2，3，4，5）和6個(gè)生化型（bvⅠ，Ⅱ，ⅡT，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ）[7-10]；二是由Fegan和Prior等提出的將青枯菌劃分為 4個(gè)演化型（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ），每個(gè)演化型又可進(jìn)一步劃分為一系列的序列變種（sequevar）[11-12]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外已有較多關(guān)于煙草青枯病菌生理分化的研究報(bào)道；美國(guó)、韓國(guó)等國(guó)家已對(duì)本地區(qū)的煙草青枯菌菌系分化情況進(jìn)行了深入研究[13-14]；我國(guó)部分地區(qū)如山東、江西、四川、湖南、安徽等也已開(kāi)展了煙草青枯菌的生理小種和生化型鑒定研究[15-19]；參照新的青枯菌劃分體系并對(duì)福建、廣西、貴州等地的煙草青枯菌演化型進(jìn)行了鑒定[20-21]。而在湖北省未見(jiàn)煙草青枯病菌生理小種、生化型或演化型的相關(guān)報(bào)道。恩施地區(qū)作為湖北省最大的產(chǎn)煙區(qū)，其煙草青枯病的發(fā)生日趨嚴(yán)重；因此，有必要對(duì)該煙區(qū)的煙草青枯菌生理小種、生化型及演化型進(jìn)行鑒定。

本研究參照傳統(tǒng)的生理小種和生化型鑒定方法，結(jié)合國(guó)際最新的青枯菌演化型分類體系，旨在初步探究湖北省恩施煙區(qū)煙草青枯病菌的生理分化情況，為湖北省煙草青枯病的防控及煙草的抗病育種工作提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株分離、鑒定

2013年6—9月分別于湖北省恩施州的宣恩、咸豐、利川等8個(gè)縣（市）煙田采集煙草青枯病病株樣品64份。采用稀釋劃線分離法[22]，在TTC培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，觀察分離結(jié)果。挑取疑似青枯菌野生型菌落轉(zhuǎn)接于NA平板，30 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，挑菌于無(wú)菌水中 20 ℃下保存?zhèn)溆谩２捎靡褕?bào)道青枯菌種的特異性引物759F?760R對(duì)分離菌株進(jìn)行分子鑒定[10]，根據(jù)擴(kuò)增條帶大小進(jìn)一步確定分離菌株是否為青枯菌。

1.2 生理小種測(cè)定

采用注莖接種法[18]，將供試菌株（濃度為108cfu/mL）分別接種青枯菌鑒別寄主煙草、番茄、茄子、馬鈴薯、花生和辣椒，每個(gè)菌株每種寄主接種2株，設(shè)立3次重復(fù)，每種寄主植物取6株接種無(wú)菌水作為對(duì)照，接種后置于溫度 30 ℃，濕度大于80%的溫室誘導(dǎo)發(fā)病，接種2 d后開(kāi)始檢查發(fā)病情況，10 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病結(jié)果。根據(jù)供試菌株接種寄主的抗感反應(yīng)確定生理小種歸屬。

1.3 生化型鑒定

參照Hayward的方法[10]，分別將3種雙糖（乳糖、麥芽糖和纖維二糖）和3種己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）配成10%的溶液，滅菌（3種雙糖用過(guò)濾法滅菌，3種己醇經(jīng)121 ℃蒸氣滅菌）后分別加入基本培養(yǎng)基中，使其終濃度為 1%。而后將供試菌株分別移至含不同碳水化合物的測(cè)定培養(yǎng)基上，在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d。根據(jù)供試菌株對(duì)3種雙糖和3種己醇的利用情況，即培養(yǎng)基的顏色變化，確定各菌株的生化型分類歸屬。

1.4 演化型鑒定

選用 MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction試劑盒（ver2.0，大連寶生物工程有限公司）提取供試菌株基因組DNA。PCR擴(kuò)增采用25μL反應(yīng)體系，其中包括10×PCR buffer，Taq酶2U，MgCl21.5 mM，dNTPs 200 μM，引物759F和760R各 4 pmol，引物 Nmult21:1F，Nmult21:2F，Nmult23:AF，Nmult22:InF，Nmult22:RR（由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成，表1）各6 pmol，DNA模板50 ng，ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?6 ℃，5 min；94 ℃，15 s；59 ℃，30 s和72 ℃，30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于1.8%的瓊脂糖凝膠中電泳，通過(guò)Biorad凝膠成像儀觀察結(jié)果。根據(jù)PCR擴(kuò)增片段大小確定供試青枯菌菌株的演化型。

2 結(jié) 果

2.1 青枯菌菌株分離、鑒定

2013年6—9月在湖北恩施地區(qū)8個(gè)縣（市）上采集病株，通過(guò)TTC培養(yǎng)基分離得到54個(gè)青枯菌野生型（菌落較大，稍凸起，不規(guī)則圓形，中央粉紅色，邊緣乳白色，白邊較寬）菌株，通過(guò)青枯菌種特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，54個(gè)菌株均能擴(kuò)增得到大小為280 bp的條帶（圖1）進(jìn)一步確定54個(gè)菌株均為青枯菌。分離菌株編號(hào)見(jiàn)表2。

2.2 生理小種鑒定結(jié)果

通過(guò)供試菌株接種青枯菌生理小種鑒別寄主后的抗感反應(yīng)，來(lái)確定其生理小種的歸屬。對(duì)6種寄主植物注莖接種2~3 d后的結(jié)果表明，54個(gè)煙草青枯菌菌株對(duì)6種鑒別寄主均有致病作用，發(fā)病率為 100%，癥狀表現(xiàn)為注射區(qū)初有褪綠斑，逐漸變的3個(gè)主栽煙草品種云煙87、畢納1號(hào)和鄂煙1號(hào)黑褐色，而后向四周擴(kuò)展，引起葉片萎蔫，最終整個(gè)植株枯萎死亡；因此，根據(jù)侵染的植物種類范圍，可將所有供試菌株劃分為生理小種1號(hào)。

2.3 生化型鑒定結(jié)果

根據(jù)青枯菌對(duì)3種雙糖和3種己醇的利用情況來(lái)確定供試菌株的生化型。鑒定結(jié)果表明，各菌株接種不同培養(yǎng)基后，培養(yǎng)基初為藍(lán)綠色，在細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基逐漸變?yōu)辄S色，這表明細(xì)菌氧化利用了培養(yǎng)基中糖或醇并產(chǎn)酸，pH下降，使培養(yǎng)基中的溴百里酚藍(lán)在酸性條件下變色。54個(gè)供試菌株均能利用3種雙糖和3種己醇，依據(jù)青枯菌生化型劃分標(biāo)準(zhǔn)，將其劃分為生化型Ⅲ。

圖1 多重PCR鑒定煙草青枯菌演化型Fig.1 The phylotypes of Ralstonia solanacearum identified by multiplex-PCR

表2 煙草青枯菌菌株來(lái)源Table 2 Original source of Ralstonia solanacearum strains

2.4 演化型鑒定結(jié)果

根據(jù)最新的青枯菌演化型分類體系，采用PCR檢測(cè)體系對(duì) 54個(gè)供試菌株的基因組 DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，54個(gè)菌株均可同時(shí)擴(kuò)增到片段大小分別為280 bp和144 bp的2條特異性片段（表2、圖1）。其中大小為280 bp的片段為青枯菌特異性擴(kuò)增條帶；144 bp的片段為演化型Ⅰ的特異性擴(kuò)增條帶。由此可知，供試的 54個(gè)青枯菌菌株均屬于演化型Ⅰ。

3 討 論

作為傳統(tǒng)的青枯菌菌系劃分標(biāo)準(zhǔn)，生理小種和生化型的劃分存在一定的局限性，即不能有效地反應(yīng)出病原菌在進(jìn)化及地理起源上的差異[11]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，F(xiàn)egan等[11]提出了1個(gè)新的分類體系，將青枯菌分為4個(gè)不同的演化型，用于描述青枯菌種以下的差異。美國(guó)、韓國(guó)等國(guó)已進(jìn)行了煙草青枯菌的生理分化研究，報(bào)道的全部生理小種測(cè)定結(jié)果為生理小種1號(hào)，而生化型和演化型的結(jié)果則不完全相同。其中美國(guó)報(bào)道的煙草青枯菌屬于生化型Ⅰ，演化型Ⅱ[13]；韓國(guó)的煙草青枯菌屬于生化型Ⅲ和Ⅳ，演化型Ⅰ[14]。在我國(guó)山東、江西、四川、湖南、安徽等地區(qū)已報(bào)道的青枯菌生理小種和生化型鑒定結(jié)果中，煙草青枯菌屬于生理小種1號(hào)，生化型存在Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ4個(gè)型，其中大部分菌株屬于生化型Ⅲ和Ⅴ[15-19]。對(duì)福建、貴州、廣西、廣東等地的煙草青枯菌演化型進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果顯示這些省份的煙草青枯菌屬于演化型Ⅰ型[12,20-21]。

4 結(jié) 論

本研究從湖北省恩施州宣恩、咸豐、利川和巴東等主要產(chǎn)煙縣（市）的感病煙株上分離得到 54個(gè)青枯菌菌株，對(duì)其生理小種、生化型和演化型進(jìn)行鑒定，將所有菌株均劃分為生理小種1號(hào)，生化型Ⅲ和演化型Ⅰ。從研究結(jié)果來(lái)看，湖北恩施地區(qū)煙草青枯菌群體結(jié)構(gòu)較為單一，生理分化現(xiàn)象不明顯，這對(duì)該地區(qū)篩選和利用煙草青枯病抗病品種是一個(gè)較為有利的條件，在煙草抗青枯病育種過(guò)程中，可以適當(dāng)?shù)呐嘤鸵M(jìn)一些針對(duì)生化型Ⅲ和演化型Ⅰ菌株選育出的新的煙草抗病品種；盡管如此，青枯菌群體具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，隨著栽培品種的不斷更替，青枯菌會(huì)不斷發(fā)生生理分化，表現(xiàn)不同的生化型。而根據(jù)演化型分類框架，每個(gè)演化型還可進(jìn)一步劃分為多個(gè)序列變種。因此，我們今后還需要分離更多煙草青枯菌，并對(duì)青枯菌序列變種水平或更詳細(xì)分類水平的差異進(jìn)行分析，為培育和篩選抗病煙草品種提供理論依據(jù)。

[1]Wicker E, Grassart L, Coranson B R, et al.Ralstonia solanacearum strains from Martinique (French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential[J].Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(21):6790-6801.

[2]Hayward A C.Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum [J].Annual Review of Phytopathology, 1991, 29(1): 65-87.

[3]周訓(xùn)軍，王靜，楊玉文，等.煙草青枯菌研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2012，39（10）：1479-1486.

[4]陳瑞泰，朱賢朝，王智發(fā)，等.全國(guó)16個(gè)生產(chǎn)煙省（區(qū)）煙草侵染性病害調(diào)研報(bào)告[J].中國(guó)煙草科學(xué)，1997，18（4）：1-7.

[5]孔凡玉.煙草青枯病的綜合防治[J].煙草科技，2003（4）：42-48.

[6]Gillings M R, Fahy P.Genomic finger rinting: towards a unified view of the Pseudomonas solanacearum species complex[M].UK：CAB International, 1994: 95-112.

[7]Buddenhagen I, Sequeira L, Kelman A.Designation of races in Pseudomonas solanacearum [J].Phytopathology，1962, 52: 726.

[8]He L Y, Sequeira L, Kelman A.Characteristics of strains of Pseudomonas solanacearum[J].Plant disease, 1983,67(12): 1357-1361.

[9]Pegg K G, Moffett M.Host range of the ginger strain of Pseudomonas solanacearum in queensland[J].Australian Journal of Experimental Agriculture and Animal Husbandry, 1971, 11: 696-698.

[10]Hayward A C.Characteristics of Pseudomonas solanacearum[J].Journal of Applied Bacteriology, 1964,27: 265-277.

[11]Fegan M, Prior P.How complex is the “Ralstonia solanacearum species complex” [M].St.Paul: APS, 2005:449-462.

[12]Xu J, Pan Z C, Prior P.et al.Genetiac Diversity of Ralstonia solanacearum strains from China[J].European Journal of Plant Pathology, 2009, 125: 641-653.

[13]Hong J C, Norman D J, Reed D L.et al.Diversity among Ralstonia solanacearum strains isolated from the southeastern United States[J].Phytopathology, 2012, 102:924-936.

[14]Yi Y K, Kim J H, kang S K, et al.Classification of Pseudomonsa solanacearumisolates from tobacco plants in Korea[J].Korean Journal of Plant Protection, 1982,21(3): 123-127.

[15]鄭繼發(fā)，丁愛(ài)云，張建華，等.山東省煙草青枯病的發(fā)生和病原菌鑒定研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，27（1）：17-22.

[16]周澤科，張超群，蔣軍喜，等.江西省煙草青枯菌生理小種及生化型鑒定[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（4）：738-742.

[17]劉旭，夏先全，姚革，等.四川省煙草青枯病的病原菌及發(fā)病規(guī)律研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21（6）：1587-1590.

[18]鄧正平，匡傳富，周志成，等.湖南煙草青枯病菌生理小種測(cè)定[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，30（1）：47-49.

[19]顧江濤，許大鳳，李英，等.安徽皖南煙區(qū)煙草青枯病病原菌生化型研究[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2008，29（3）：60-61.

[20]徐進(jìn)，顧剛，潘哲超，等.福建煙草青枯菌演化型及生化變種鑒定研究[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2010，16（6）：66-71.

[21]潘哲超，徐進(jìn)，顧剛，等.福建及貴州等地?zé)煵萸嗫菥到y(tǒng)發(fā)育分析[J].植物保護(hù)，2012，38（1）：18-23.

[22]鄒陽(yáng)，肖崇剛，易龍，等.重慶地區(qū)煙草青枯病菌的生物型測(cè)定[J].煙草科技，2007（6）：62-64.