楊 歡，余 君，王昌軍，李進(jìn)平，施河麗，譚 軍，李錫宏，王 瑞，徐迪紅，陳守文*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.湖北省煙草科研所，武漢 430030；3.湖北省煙草公司恩施州公司科技中心，湖北 恩施 445000）

煙草是一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)多個(gè)地方都有種植區(qū)域，然而一些細(xì)菌性、真菌性與病毒病害等給煙葉生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的損失，嚴(yán)重制約了高效農(nóng)業(yè)的發(fā)展。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，煙草花葉病、赤星病、黑脛病、青枯病和根結(jié)線蟲(chóng)病5種煙草主要病害造成的產(chǎn)量損失為4.8億多公斤，產(chǎn)值損失高達(dá) 15億多元[1]。煙草青枯病是由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種土傳細(xì)菌性病害，可浸染煙草、馬鈴薯、番茄、茄子、辣椒等54個(gè)科的450多種植物[2]，以危害根、莖為主[3]，是典型的維管束病害。目前，青枯病防治措施主要有農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治等。其中，抗病品種連作會(huì)引起作物抗性衰退[4]，防治效果差，而化學(xué)農(nóng)藥殘留帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境污染。相對(duì)于傳統(tǒng)防治方法而言，生物防治因其環(huán)境友好型、防治效果顯著等特點(diǎn)，近年來(lái)成為植物病害防治的研究熱點(diǎn)。生物防治是利用對(duì)土傳病害有拮抗效果的微生物或其代謝物，抑制病原微生物的生長(zhǎng)，達(dá)到防治土傳病害發(fā)生的目的[5]，是一種環(huán)保無(wú)公害的方法。

微生物生防機(jī)制主要包括競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、誘導(dǎo)抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等。對(duì)于一個(gè)理想的生防菌而言，既要具有產(chǎn)生有效拮抗病原菌因子的能力，又要很好的定殖于植株體內(nèi)或根部以占據(jù)有利的生態(tài)位[6]。因此想要獲得較好的病害防效，必須考慮生防菌株在植物體內(nèi)的定殖能力。王靜等[7]、張秀玉等[8]從煙草根際土壤分離到一株枯草芽胞桿菌SH7，分泌的抗菌蛋白對(duì)青枯病菌具有良好的抑制作用。

本研究供試生防菌解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）YH-22分離篩選自恩施州烤煙種植區(qū)域的健康煙葉，對(duì)煙草青枯病有一定防效。以利福平抗性誘導(dǎo)，獲得利福平抗性株，研究了該菌株在煙草根際土壤和組織體內(nèi)的定殖情況。為了進(jìn)一步探討該菌株的抗病機(jī)制，對(duì)其抗菌物質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 菌種及煙草

生防菌株解淀粉芽胞桿菌YH-22（篩選自健康煙草葉片）；煙草青枯病病原菌茄科雷爾氏菌9-2、煙草K326均由湖北省煙草科學(xué)研究院提供。

1.2 培養(yǎng)基

NA液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，1000 mL水，pH 7.2～7.4；TTC固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，紅四氮唑0.10 g，1000 mL水，瓊脂粉18.0，pH 7.2～7.4；紅四氮唑溶液（TTC）：0.10 g紅四氮唑溶于10 mL蒸餾水配成母液，使用前用滅菌的0.22 μm無(wú)機(jī)濾膜過(guò)濾，100倍稀釋用；LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，1000 mL水，pH 7.0～7.5，固體培養(yǎng)基加入1.8%瓊脂；發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉 15 g，豆粕 50 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.75 g，MnSO4·H2O 0.01 g，1000 mL水，pH 7.5。

1.3 利福平抗性誘導(dǎo)

先將篩選的拮抗菌株YH-22按2%的接種量接入含有5 μg/mL利福平的LB中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，然后接入含10 μg/mL利福平的LB中，以此逐級(jí)轉(zhuǎn)接于含 20、50、100、150、200、300、400 μg/mL利福平的LB中進(jìn)行抗性誘導(dǎo)。同時(shí)驗(yàn)證抗400 μg/mL利福平菌株抗利福平能力和抗青枯病菌活性的穩(wěn)定性。

1.4 盆栽定殖試驗(yàn)

2012年10月煙草育苗，12月份將2個(gè)月苗齡的煙草移入盆缽中，盆栽土壤使用前每隔12 h間歇滅菌1次，每次121 ℃、30 min，然后80 ℃烘干，共滅菌、烘干3次。盆缽置于溫室中，溫室培養(yǎng)溫度為28～30 ℃，相對(duì)濕度為65%，16 h光照（白天）、8 h黑暗（晚上）。12月中旬，將菌株YH-22對(duì)煙苗進(jìn)行灌根100 mL（接菌濃度為107CFU/mL），分別于灌根后第4、16、23、30、60天分別取樣（根際土壤、根圍土壤、根、莖）檢測(cè)拮抗菌的定殖情況：采用LB抗性平板，利福平濃度為100 μg/mL。每個(gè)處理做3盆，3次重復(fù)。取10 g土樣于90 mL無(wú)菌生理鹽水，做系列稀釋10-3、10-4、10-5，同時(shí)分別稱取20 g根圍土壤，風(fēng)干后測(cè)量其pH；根（莖）沖洗干凈后風(fēng)干，進(jìn)行表面消毒（75%無(wú)水乙醇浸泡10 s，10% NaClO浸泡5 min，無(wú)菌生理鹽水洗滌 3次），于滅菌研缽中加適量水研磨成組織液后稀釋涂布于 LB抗性平板，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12～24 h，記錄菌落數(shù)。

1.5 平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)

煙草青枯病病原菌茄科雷爾氏菌接入NA液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h，以5%體積比加入冷卻至60 ℃左右的TTC固體培養(yǎng)基得到含菌培養(yǎng)基；拮抗菌YH-22接入LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)10～12 h后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵48 h，8000 r/min離心15 min收集上清。在含菌培養(yǎng)基中打孔，每孔加入50 μL檢測(cè)液，檢測(cè)其抗煙草青枯病原菌活性。

1.6 抗菌物質(zhì)理化性質(zhì)初步研究

有機(jī)溶劑溶解性[9]：將發(fā)酵液離心上清分別與氯仿、乙酸乙酯等量混合后震蕩 1 h，靜置萃取30 min后，分別取50 μL萃取相和萃余相加入含菌TTC平板的孔中，檢測(cè)抗菌活性。

熱穩(wěn)定性[10]：YH-22的36 h的發(fā)酵液離心上清除菌后，分別在80 ℃、110 ℃、115 ℃、121 ℃處理30 min，放置至室溫，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，測(cè)定對(duì)煙草青枯病原菌的拮抗活性。

酸堿穩(wěn)定性[11]：用 3 mol/L鹽酸或 NaOH將YH-22發(fā)酵液離心上清pH分別調(diào)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，置于4 ℃冰箱24 h，然后回調(diào)pH至7.0左右，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，分別測(cè)定濾液對(duì)煙草青枯病原菌的拮抗活性。

酶的耐受性[12-13]：將YH-22發(fā)酵液離心上清分別加入1 mg/L的中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，置于37 ℃水浴保溫1 h后，80 ℃水浴3 min終止反應(yīng)，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，分別測(cè)定濾液對(duì)煙草青枯病原菌的拮抗活性。

紫外線穩(wěn)定性[14]：將YH-22發(fā)酵液離心上清置于紫外燈（8 w）下照射30 min，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，后測(cè)定濾液對(duì)煙草青枯病原菌的拮抗活性。酸沉淀、排油特性、液滴坍塌性具體方法均見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析方法

抗菌物質(zhì)理化性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS18.0軟件的 Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著差異性（p＜0.05）分析。

2 結(jié) 果

2.1 利福平抗性誘導(dǎo)

將菌株YH-22逐級(jí)接入含有5、10、25、50、100、200、300、400 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12～24 h，最終獲得了抗400 μg/mL利福平的菌株，傳代10代后，其抗菌作用與原始菌株接近，利福平抗性能力和第一代抗性誘導(dǎo)菌株保持一樣。

2.2 盆栽定殖能力檢測(cè)

將抗400 μg/mL利福平的抗性菌株YH-22接入LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h得種子液，以2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，得菌懸液，用灌根法接種于團(tuán)棵期的煙草K326植株根部，分別在灌根接種后的第 0、4、16、23、30、60天取樣檢測(cè) YH-22的存活量，其生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)結(jié)果見(jiàn)表1。

接種后第4天，根和莖均未檢測(cè)到菌株。第16天，根里開(kāi)始檢測(cè)到菌株，后期菌數(shù)基本保持穩(wěn)定，維持在103CFU/g鮮質(zhì)量。在第23天，莖里開(kāi)始檢測(cè)到菌株。第 30天，根和莖中拮抗菌大增，分別增加了4.0倍和6.8倍，說(shuō)明煙草正處于旺長(zhǎng)期，合成了大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為定殖的拮抗菌提供了生長(zhǎng)繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。第 60天，根和莖的菌株數(shù)量銳減，分別降低了70.0%和98.4%，說(shuō)明煙草趨于成熟，合成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較少，使得拮抗菌株因缺少營(yíng)養(yǎng)來(lái)源而繁殖力降低。而土壤中拮抗菌的菌量保持在105CFU/g土壤，從第4～30天，拮抗菌株數(shù)量呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，第60天，根際土壤和根圍土壤的菌數(shù)分別降低到第30天的58.5%和82.2%，這和植株中定殖的拮抗菌數(shù)量的變化相似。植株中菌量為102～103CFU/g組織，菌數(shù)并不高，可能原因是拮抗菌灌根接種濃度（107CFU/mL，100 mL）較低，這與易有金[16]研究中菌株在107CFU/mL接種時(shí)在煙草體內(nèi)未被檢測(cè)到的結(jié)果相類似。

表1 YH-22菌株在煙草K326上的定殖能力檢測(cè)Table 1 The detection of the colonization ability of strain YH-22 in tobacco K326

2.3 抗菌物部分理化性質(zhì)

2.3.1 有機(jī)溶劑溶解性 用氯仿、乙酸乙酯與發(fā)酵液離心上清振蕩混合1 h后靜置萃取30 min后，分別檢測(cè)萃取相和萃余相的抗菌活性。萃取液均無(wú)抗菌活性，萃余相均有抗菌活性，且萃取相的抑菌活性和未經(jīng)有機(jī)溶劑處理的上清液相差不大，說(shuō)明該抗菌物質(zhì)為水溶性物質(zhì)而不溶于有機(jī)溶劑氯仿和乙酸乙酯[13]，結(jié)果如圖1所示。

圖1 抗菌物質(zhì)的有機(jī)溶劑溶解性Fig.1 The antibactiral substances solubility in organic solvent

2.3.2 穩(wěn)定性 將發(fā)酵離心上清過(guò)濾除菌后，分別經(jīng)不同溫度、pH、酶和紫外線處理，放置至室溫，測(cè)定青枯病菌拮抗活性，結(jié)果如圖2所示。圖 2A中，在80 ℃、110 ℃、115 ℃、121 ℃處理30 min后，活性分別保留為71.0%、33.8%、9.7%、2.7%，說(shuō)明該拮抗活性組分具有一定的耐熱性；圖2B中，抗菌物質(zhì)在pH 4～10下穩(wěn)定，pH 8時(shí)活性最高，抑菌圈為6.50 mm；圖2C中，抗菌物質(zhì)經(jīng)中性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后，活性分別保留有60.3%、65.7%和95.6%，前二者酶處理活性有所降低，說(shuō)明該抗菌物質(zhì)中含有蛋白成分，這和齊愛(ài)勇等[9]的研究結(jié)果類似，他們從枯草芽胞桿菌B21的發(fā)酵離心上清中分離純化到43.0 KD的抗菌蛋白，對(duì)胰蛋白酶和蛋白酶K部分敏感；圖2D中，上清經(jīng)紫外線照射后，活性保留93.0%。

圖2 抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of antibactiral substances by different treatments

2.3.3 酸沉淀 將發(fā)酵液離心上清在 pH 2.0的條件下進(jìn)行沉淀，離心收集沉淀，用甲醇溶解，檢測(cè)甲醇萃取液的拮抗活性，發(fā)現(xiàn)酸沉淀后的上清和甲醇本身沒(méi)有拮抗活性，而甲醇溶解的沉淀拮抗活性較強(qiáng)，結(jié)果如圖3所示，該抗菌物質(zhì)大部分能在pH 2.0沉淀下來(lái)，這是因?yàn)榭咕鞍谆蛑念愇镔|(zhì)在強(qiáng)酸條件下會(huì)變性而形成絮狀物沉積下來(lái)，說(shuō)明該抗菌物質(zhì)為蛋白類或脂肽類物質(zhì)，而甲醇溶解后仍有很強(qiáng)的抑菌活性，而脂肽可以溶解于甲醇，從而進(jìn)一步說(shuō)明抗菌物質(zhì)中含有脂肽類物質(zhì)。

圖3 酸沉淀抑菌活性Fig.3 Bacteriostatic activity of acid precipitation

2.3.4 表面活性劑特性 枯草芽胞桿菌分泌的抗菌脂肽surfactin是高活性的生物表面活性劑[17]，具有溶血、排油、液滴坍塌、凝聚特性[15]，實(shí)驗(yàn)中將發(fā)酵液滴加到油膜中心，發(fā)現(xiàn)油膜迅速被打散成一個(gè)個(gè)圓圈，說(shuō)明該活性物質(zhì)具有排油的特性；另外，將發(fā)酵液滴在parafilm膜上，液滴慢慢坍塌，而不是保持球形結(jié)構(gòu)，說(shuō)明該抗菌物質(zhì)具有使液滴坍塌的特性，這進(jìn)一步表明該抗菌活性物質(zhì)含有脂肽類物質(zhì)。

3 討 論

生防菌只有在植物體內(nèi)占據(jù)很好的生態(tài)位，才有可能發(fā)揮更好的防效。而生防菌侵入植物體內(nèi)的方式和其定殖部位是決定生防菌施用方式和施用時(shí)間的關(guān)鍵因素?？赏ㄟ^(guò)構(gòu)建工程菌株，如熒光蛋白基因標(biāo)記，對(duì)生防菌株在植株上的定殖進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤，研究抗病菌株發(fā)揮生防作用的部位以及菌株在植株中的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，以確定生防機(jī)制屬于拮抗、競(jìng)爭(zhēng)、寄生還是誘導(dǎo)植株系統(tǒng)抗性中的哪一種[18]，為生防菌劑的施用提供理論指導(dǎo)。

芽胞桿菌抗菌物質(zhì)主要有蛋白質(zhì)和脂肽兩大類，通過(guò)對(duì)抗菌物質(zhì)理化性質(zhì)的研究，可以初步確定抗菌物質(zhì)的種類，進(jìn)而采取相應(yīng)的分離純化的方法，對(duì)抗菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步分析?？刹捎昧蛩徜@沉淀和酸沉淀進(jìn)行純化，將純化的樣品做質(zhì)譜分析，以確定該拮抗物質(zhì)的種類。如果是脂肽類，可采用酸沉淀，用甲醇抽提，將抽提液進(jìn)行HPLC，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品（如iturin、surfactin、fengycin）進(jìn)行含量測(cè)定；如果是蛋白類，可用硫酸銨逐級(jí)沉淀，磷酸緩沖液溶解，將溶解液透析除鹽后進(jìn)行SDS-PAGE，確定蛋白種類和大小，并測(cè)定所分離蛋白粗提物的抗菌能力，選擇較強(qiáng)抗菌能力的蛋白拮抗物進(jìn)行氨基酸序列分析、基因克隆或基因?qū)氡磉_(dá)以確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

在根際土壤、根、莖先后檢測(cè)到了菌株YH-22，說(shuō)明菌株 YH-22在煙草組織內(nèi)具有一定的定殖能力。后期可以考慮構(gòu)建工程菌株，如熒光蛋白基因標(biāo)記，研究抗病菌株在植株具體部位中的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，為生防菌劑的施用提供理論指導(dǎo)。

解淀粉芽孢桿菌 YH-22對(duì)青枯病菌具有抗性的物質(zhì)，對(duì)胰蛋白酶和中性蛋白酶具有一定的耐受性，能耐受紫外線和胃蛋白酶，不溶于氯仿和乙酸乙酯，具有排油和使液滴坍塌的表面活性劑特性，具有一定的耐熱性，可初步確定該抗菌活性物質(zhì)是蛋白和脂肽的混合物。至于其結(jié)構(gòu)的鑒定，要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分離純化，如硫銨沉淀、酸沉淀、HPLC、SDS-PAG等；通過(guò)氨基酸序列分析、基因克隆或基因?qū)氡磉_(dá)等方法確定其結(jié)構(gòu)。

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