秦紅霞 趙 玲 王宇豪 寧椿游 羅 毅

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院；1四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，雅安625014）

前脂肪細胞與體內(nèi)脂肪沉積以及人類代謝性疾病密切相關(guān)［1，2］，前脂肪細胞的分化過程一直是生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點。在前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的過程中，細胞形態(tài)會發(fā)生一系列變化，前脂肪細胞首先由成纖維細胞樣形狀逐漸趨于類圓或圓形，胞體逐漸增大，胞質(zhì)中開始出現(xiàn)小脂滴，隨著分化的進展，胞質(zhì)內(nèi)的小脂滴逐漸增多，小脂滴逐漸地融合為較大的脂滴［3］，細胞核被推向細胞的邊緣，最終為成熟脂肪細胞的形態(tài)特征。細胞內(nèi)脂滴的多少是判定脂肪細胞分化程度的重要指標。脂肪細胞內(nèi)脂滴的染色有兩種方法，即油紅O染色和尼羅紅熒光染色法。油紅O染色法是國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的一種方法，而國內(nèi)有關(guān)尼羅紅染色法用于鑒定脂肪細胞內(nèi)脂滴的研究還非常有限。迄今為止，有關(guān)上述兩種染色方法的比較研究仍未見報道。故本實驗采用尼羅紅染色和油紅O染色法分別對脂肪細胞內(nèi)脂滴進行染色，綜合比較兩種方法的優(yōu)劣，旨在探討科研工作中更優(yōu)的脂滴染色方法。

材料和方法

1．材料

1．1細胞

3T3－L1前脂肪細胞（購自中國科學(xué)院細胞庫）

1．2主要儀器

Varioskan全波長酶標儀（Thermo）、CO2培養(yǎng)箱、IX71倒置熒光顯微鏡（Olympus）、生物安全柜（Thermo）

1．3主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone）、新生牛血清（Gibco）、油紅O（上海生物工程公司）、尼羅紅染液（Lonza）、胰島素（Sigma）、地塞米松（Sigma）、IBMX（Sigma）、羅格列酮（Sigma）

2．方法

2．1 3T3－L1前脂肪細胞的誘導(dǎo)分化

采用經(jīng)典的"雞尾酒"法誘導(dǎo)前脂肪細胞，具體操作如下：將3T3－L1前脂肪細胞以5×103個／孔的密度接種于96孔板，待細胞完全融合后2d（此時為誘導(dǎo)分化的0d），換為含有170nM 胰島素、0．5mM IBMX和1μM地塞米松的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液。2d后，吸棄培養(yǎng)液，加入含170nM胰島素的維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2d；其后，換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2d換液一次，直至第8d。在細胞內(nèi)甘油三酯定量檢測過程中設(shè)立對照組與羅格列酮（RSG）處理組，每個處理組設(shè)六個重復(fù)。RSG處理組在細胞分化過程中全程加入RSG（終濃度1μM），對照組則加入同體積的PBS。

2．2油紅O染色

將誘導(dǎo)分化至第8d的細胞培養(yǎng)板取出，棄去培養(yǎng)液，用0．01mM pH7．4的PBS輕輕洗滌2～3次；用10%Baker＇s福爾馬林鈣液固定細胞60min；吸棄固定液，用PBS清洗3遍；加入油紅O染液于細胞表面，室溫下染色30min；棄染液，并用PBS輕洗3次；將培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，拍照。拍照結(jié)束后加入60μL／孔的異丙醇萃取脂滴中的油紅O，室溫放置20min，吸取萃取出的染液50μL／孔轉(zhuǎn)移至潔凈的96孔培養(yǎng)板中，于490nm處測定吸光度值，以相同的方法處理PBS對照組。

2．3尼羅紅熒光染色

將誘導(dǎo)分化后8d的3T3－L1細胞取出，棄去培養(yǎng)液，用PBS（pH 7．4）漂洗后，每孔加入200μL PBS；在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入5μL尼羅紅染液，適當振蕩。靜置10min后，將96孔培養(yǎng)板放入全波長酶標儀中，于激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長572nm下測定熒光強度。然后，將96孔培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

3．統(tǒng)計學(xué)處理

實驗所得數(shù)據(jù)以mean±sd表示，用SAS 9．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用t檢驗進行差異顯著性分析。

結(jié) 果

1．脂滴的鑒定

當細胞分化至第8d，取出細胞置于倒置顯微鏡下觀察，視野中富含大量類似液泡的圓形脂滴（圖1A）。經(jīng)油紅O染色后，脂滴被親脂的油紅O著色成橘紅色，從而證明視野中的圓形脂滴非液泡（圖1B）。而細胞經(jīng)尼羅紅熒光染色后，經(jīng)倒置熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)脂滴發(fā)出桔黃色熒光（圖1C）；而在明場下觀察尼羅紅染色后的脂滴則呈淺紅色（圖1D）。上述結(jié)果顯示，油紅O染色與尼羅紅熒光染色均可鑒定脂肪細胞內(nèi)脂滴的生成情況。

2．細胞內(nèi)甘油三酯蓄積程度的測定

油紅O萃取法和尼羅紅熒光檢測法均可定量檢測細胞內(nèi)甘油三酯的蓄積程度。為證明上述兩種方法對檢測結(jié)果是否一致，本實驗在細胞分化過程中，設(shè)立了羅格列酮組和PBS組。羅格列酮是一種PPARγ激動劑，能顯著促進細胞內(nèi)甘油三酯的合成［8］。細胞內(nèi)甘油三酯測定結(jié)果如圖2所示，兩種染色法檢測結(jié)果均顯示RSG組細胞內(nèi)甘油三酯的含量均顯著高于PBS組（P＜0．05），檢測結(jié)果一致。

圖2 兩種染色方法細胞中甘油三酯含量測定比較Fig．2Comparison of two staining methods for detection of intracellular triglyceride content

3．兩種染色法區(qū)別

油紅O染色法和尼羅紅染色法的區(qū)別如表1所示。油紅O染色法耗時較長，操作步驟繁瑣，但對檢測儀器要求不高。相反，尼羅紅染色法耗時短，染色步驟簡便，但需要能檢測熒光信號的儀器設(shè)備。

表1 油紅O染色法和尼羅紅染色法區(qū)別Table 1 Difference between Oil Red O staining and Nile Red staining

討 論

細胞內(nèi)脂滴的生成情況可判定脂肪細胞的分化程度。傳統(tǒng)的脂滴鑒定和定量檢測是通過油紅O染色法進行的。油紅O是一種紅色的脂溶性染料，可與組織、細胞中的甘油三酯發(fā)生特異性結(jié)合，將脂滴染成橘紅色。通過萃取脂滴中的油紅O染料，再采用分光光度計檢測OD值，OD值越大表明甘油三酯含量越高［4］，所以該方法還可定量檢測細胞內(nèi)甘油三酯蓄積程度。尼羅紅是一種親脂性的惡嗪類熒光染料，能與細胞內(nèi)中性甘油三酯結(jié)合發(fā)出熒光［5］，其熒光強度與甘油三酯含量顯著相關(guān)，故通過熒光顯微鏡以及熒光酶標儀能觀察和測定甘油三酯的多少，從而考察脂肪細胞脂滴的生成情況。本實驗結(jié)果與已有的文獻［6－8］均顯示兩種染色法都可鑒定或定量檢測脂肪細胞內(nèi)甘油三酯蓄積程度。但油紅O染色過程需要固定、洗滌、染色和再洗滌等過程，導(dǎo)致該方法操作過程較為繁瑣、耗時較長，染料不易清洗干凈，導(dǎo)致染料殘留，從而出現(xiàn)實驗誤差，影響測定結(jié)果。與油紅O染色法相比，尼羅紅染色只需吸棄培養(yǎng)液，加入PBS和染料即可，操作簡單、耗時短以及背景更潔凈，實驗的準確性更高。但尼羅紅染色法的應(yīng)用需要實驗室裝備熒光顯微鏡或能檢測熒光信號的酶標儀。綜合以上實驗和論述，油紅O染色法和尼羅紅染色法用于研究細胞內(nèi)脂滴的生成情況均能獲得較為理想的實驗結(jié)果，但為了提高實驗的準確性，減少實驗的誤差，并具備實驗條件的情況下，推薦采用尼羅紅熒光染色法應(yīng)用于脂肪細胞內(nèi)脂滴的鑒定和定量測定。

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